Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

Решающим условием успешной генотерапии является обеспе-

чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком

смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто-

ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель-

ной персистенции его в этих клетках и создание условий для

полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может

проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК,

лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси-

рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями,

белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE -

декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота),

либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли-

шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис-

тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее

встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва-

ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так

называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации

даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной

экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи-

мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие

соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес-

пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного

гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос-

новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя-

ются на химические, физические и биологические. Эффектив-

ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро-

ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в

ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.

Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек-

ции in vitro (Culver, 1994).

--------------------T------------T-------------T------------¬

¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦

¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦

¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦

¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦

¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦

¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦

¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦

¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦

¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦

L-------------------+------------+-------------+-------------

Как следует из представленных данных, введение чужерод-

ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-

мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,

бомбардировки частицами золота), так и, практически, при

всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью

рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном

клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-

ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих

необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-

ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-

вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-

на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические

конструкции, включающие вирусные последовательности способны

к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-

прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,

что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-

гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны

на применении ретровирусных векторов.

Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,

Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-

сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)

трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-

кой пакующей способностью (включение генетической конструк-

ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-

интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно

важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-

когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-

тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на

пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).

Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-

шенствование методов трансформации клеток

человека.

9.4.1. Основные векторные системы.

В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.

Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-

муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-

лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-

кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую

последовательность определенного гена, инсертированную в

экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием

сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от

многих параметров, главным из которых является необходимый

уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-

держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-

та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-

цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию

либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для

генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-

ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген

(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-

изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-

дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-

мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции

удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-

лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-

териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не

способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.

Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в

клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-

ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение

через клеточные мембраны.

9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в

клетки эукариот.

Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно

проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных

клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.

Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-

жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где

обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только

небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает

в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-

жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-

ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,

в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и

низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1

года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-

риллах (Hansen et al.,1991).

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в

ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции

(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания

трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-

леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи

электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-

рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70