Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>ленные из тканей линейных животных, служащих генетической

моделью наследственного заболевания.

Идентификация гомологичных генов у экспериментальных

животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют

исследование функциональной активности нормальных и мутант-

ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме-

ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле-

жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по-

лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци-

рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо-

дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен

чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе-

риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии

генов.

Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция

и исследование мРНК, искусственные

транскрипционные системы.

Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок

может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В

соответствии с этим исследования дифференциальной активности

генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы

контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех

этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и

изучение соответствующего белкового продукта, включая его

процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка-

неспецифическое распределение .

Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге-

нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю-

щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку-

лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов

проводят с использованием разнообразных современных методов

молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в

5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци-

фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы

путем исследования транскрипции в различных линиях клеток

при введении в них генов с искусственными делециями этих

участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу-

ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо

изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы-

ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в

составе векторных последовательностей вводят в культивируе-

мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня

экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло-

рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест-

венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.

Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя-

ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в

клетке, но и с высокой точностью проводить количественную

оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи-

мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек

африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди-

фицированы таким образом, что в них после трансфекции про-

исходит амплификация копий сконструированных определенным

образом эписом (внехромосомных генетических конструк-

ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг-

налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов

(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга-

низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных

манипуляций трансгенные животные могут быть также использо-

ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов

тканеспецифической активации генов in vivo.

Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для

изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных

модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%

из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-

руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При

этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов

среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от

0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения

индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-

чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на

тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ

РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических

срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов

используют клонированные последовательности кДНК и синтети-

ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на

цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой

несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-

вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-

бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-

тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не

только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-

лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,

Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).

Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей

пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-

цию среди них специфических молекул путем использования раз-

личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким

уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты

(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не

могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-

лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и

фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-

водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью

обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-

ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-

центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-

кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в

агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В

этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель

находится в логарифмической зависимости от длины последова-

тельности, что позволяет точно определить размер РНК

транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде

двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-

мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы

в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой

отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри-

дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то

преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо-

лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.

Кроме того, характер электрофоретического разделения позво-

ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень

низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,

когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими

компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной

тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках

фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную

РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T

олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра-

цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со-

держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При

снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление

A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом

доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть

увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима

в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество

тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК

транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб-

ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для

переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так

и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп-

лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана-

лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для

анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения

направления транскрипции и картирования интронов.

Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети-

ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек-

тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа-

да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди-

намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино-

мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип-

цию.

Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер-

вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием

искусственным образом сконструированных транскрипционных

систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;

Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70