Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом

случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы

используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с

добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-

фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради-

оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК

оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово-

дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее

описанных методов анализа мРНК, используют немеченые

кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим

достоинством этой транскрипционной системы является ее

максимальная приближенность к естественным процессам. При

втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен-

тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и

регуляторных белков.

Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе-

мы.

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и

посттрансляционных модификаций белков основаны на использо-

вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати-

ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-

жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино-

кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга

белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав-

ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез

соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении

меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки

после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова-

ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,

при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,

для значительного числа моногенных наследственных заболева-

ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова-

тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими-

ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного

содержания и отсутствия эффективных методов выделения и

очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от-

носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными

структурами клеток.

ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу-

ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным

средством анализа структуры, функции и синтеза белков

(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно-

ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь-

ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива-

ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень

экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов

инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин-

женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч-

но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,

в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу

рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях

экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге-

нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию

чужеродных белков в клетках.

Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль-

ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и

экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих

систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные

системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким

уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и

их используют, обычно, для производства большого количества

чистого белка, необходимого для получения антител или для

фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-

ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем

сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-

ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-

тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-

мости различных участков белка.

Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-

ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем

в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют

ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-

ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее

использовать для изучения посттрансляционных модификаций

белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-

тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-

ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения

дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-

щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может

быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить

его в кристаллической форме и исследовать пространственную

структуру и функциональное назначение отдельных доменов

(Хэймс, Хиггинс, 1987).

Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-

дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.

Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене-

тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и

произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных

последовательностей в составе белков с уже известной струк-

турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по

своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег

чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле-

дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность

белка позволяет прогнозировать его третичную структуру,

идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость

целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным

практическим следствием этих данных является также возмож-

ность получения антител к строго специфичным участкам бел-

ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими-

ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму-

низации используют искусственно синтезированные полипептиды,

которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).

Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино-

кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто-

имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором

подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный

вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль-

тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в

котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти-

руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо-

го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации

животных и получения моновалентных или моноклональных анти-

тел. При наличии антител могут быть применены различные им-

мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и

внутриклеточного распределения белка, исследования его моди-

фикаций, а также для получения нативного белка в препаратив-

ных количествах.

Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов

регуляции экспрессии гена является идентификация тех наруше-

ний в структуре, локализации и активности молекул мРНК и

белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы

уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток

для подобных исследований. Однако, многие патологические

процессы, протекающие в организме больного, не могут быть

исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получе-

ния необходимого количества клеток и тканей пациента и испы-

тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.

Поэтому для многих наследственных болезней эффективность

изучения основ патогенеза существенным образом зависит от

наличия адекватных биологических моделей. Способы конструи-

рования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.

ГЛАВА II.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-

тов.

Термин геном используется для обозначения полной гене-

тической системы клетки, определяющей характер онтогенети-

ческого развития организма и наследственную передачу в ряду

поколений всех его структурных и функциональных признаков.

Понятие генома может быть применено к таксономической груп-

пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви-

русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про-

кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности

строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из-

менениями, происходящими в геноме специфических клеток в

процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном

определяется как генетическая информация, заключенная в мо-

лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как

отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид-

ный геном и таксономическим статусом видов, а также много-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70