Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку

клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные

последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-

hen-Haguenauer, 1995).

Важнейшим элементом в программе генной терапии является

анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-

дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на

различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-

ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента

и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.

Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в

конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК

в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-

мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии

введенных генов путем идентификации и количественной оценки

соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта

гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ

коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-

лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-

дицинского обследования и вносят необходимые исправления и

добавления в проводимую схему лечения.

Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-

бор клеток-мишеней.

Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе

построения программ генной терапии. Итак, генная терапия

предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише-

ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па-

тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо

для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст-

ранению патологических процессов. В первом случае, в орга-

низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного

гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева-

ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены,

обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству-

ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для

таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ-

фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель-

но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом,

в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге-

нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции

могут служить самые разные соматические клетки, как несущие

дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера-

певтические свойства после трансфекции. В зависимости от

способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те-

рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo),

либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная

терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи-

вирование специфических типов клеток пациента, введение в

них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин-

фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время

большинство допущенных к клиническим испытаниям программ

генной терапии использует именно этот подход (Cul-

ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в

крупных специализированных центрах, требует больших матери-

альных затрат и высоких биотехнологий.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло-

нированных и определенным образом упакованных последователь-

ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые

ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими

их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень

перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко

распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь-

ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен-

но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс-

таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе-

мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как

правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких

как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта-

ми генетической модификации являются специфические типы ле-

гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут

использоваться для модификации различных типов клеток и со

временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и

универсальным способом доставки чужеродного генетического

материала в любые ткани.

Эффективность курса генной терапии в значительной сте-

пени зависит от правильного выбора типов соматических кле-

ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика-

ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного

заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге-

нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю-

бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан-

ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует-

ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы

генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи-

ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер-

вичного биохимического дефекта, исследование структуры,

функции и внутриклеточного распределения его белкового про-

дукта, а также биохимический анализ патологического процес-

са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую-

щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти-

ческих вмешательств определяется также доступностью кле-

ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга-

низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле-

ток, длительностью экспрессии введенного гена.

Наиболее перспективной представляется возможность гене-

тической модификации не самих уже дифференцированных клеток

с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть

долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей

является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых

клеток, которые при создании определенных микроусловий могут

дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки

организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи

предложенный недавно эффективный метод получения стволовых

клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии

наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).

Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене-

тической модификации, завершается оценкой результатов пере-

носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на

животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба-

цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про-

водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного

либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари-

тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных

моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса

экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической

конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет-

ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и

его коррекции на биохимическом уровне.

Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть

решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия-

ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи-

модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор-

ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi-

vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли-

чество синтезированного белка, необходимое для нормализации

биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от-

вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно

быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.

Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую

систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про-

верка надежности работы этой системы может быть осуществлена

только на уровне целого организма. Показатели длительности и

характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут

использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров

для оценки необходимой периодичности повторения терапевти-

ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в

первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже-

родного гена и опасность вирусной контаминации в результате

использования компетентного по репликации вектора (см.ниже),

могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в

программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo

на естественных или искусственно полученных моделях соот-

ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу

VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи-

вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной

терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли-

нических испытаний.

Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70