Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)

p>рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки

состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-

иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-

ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч

пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-

щихся последовательностей геномной ДНК человека получается

после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или

Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-

личество клонов с различными инсертированными фрагментами

ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-

мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в

одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные

библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -

10!6 различных клонов.

Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или

космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче

хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-

отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на

основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая

способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много

удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут

быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-

ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто

используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-

ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не

вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для

создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,

используется технология искусственных дрожжевых хромосом

-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)

фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-

нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-

ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных

ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или

космидных библиотеках.

Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на

фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными

ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека

сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).

Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают

на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-

зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-

зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.

Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие

чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры

и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят

их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-

ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-

тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-

тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на

рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-

зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК

последовательности, комплементарные зонду, или специфические

антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных

культурах производят именно в тех местах, где произошло по-

темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,

отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-

нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и

субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать

большие количества этой ДНК.

1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного

ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-

ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-

ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-

ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул

ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,

однако, определение нуклеотидной последовательности протя-

женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-

дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-

ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -

метод Сэнджера. В первом случае используют химическое

расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют

нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез

на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так

как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-

го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-

руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют

секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-

нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-

ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-

ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного

участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную

смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,

один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-

рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют

один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов

- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на

место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-

щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и

тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-

ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-

ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-

рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов

может быть определен, а значит и определена локализация ди-

дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов

в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем

геле может быть определена первичная последовательность все-

го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте

этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.

Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК

в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет

назад оценивалась в 1$.

В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-

варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных

на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых

участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-

ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-

залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс

одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-

шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология

автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным

для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-

лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-

нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-

ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается

автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение

в реализации программы Геном человека. По последним данным,

разработка автоматических секвенаторов позволила снизить

стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-

ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах

фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-

но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.

В последние годы активно разрабатываются принципиально

новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-

ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой

последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-

ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский

и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для

этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых

пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-

да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-

рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-

деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество

возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-

емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют

с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется

только с теми октануклеотидами, последовательности которых

комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-

бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-

дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной

компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-

тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод

позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет

автоматизации процесса.

1.7 Полимеразная цепная реакция.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70