Культивирование вирусов
нескольких сотен клеток;
- гладкую поверхность;
- прозрачность;
- отсутствие токсичности компонентов для клеток;
- незначительное впитывание компонентов среды;
- универсальность, обеспечивающую возможность использования их для
первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют
свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.
Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной
химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-
агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля,
полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как
микроносителей.
Пригодными являются только некоторые из них, главным образом имеющие в
своей основе ПС-декстран.
Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты
микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Швеция),
Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных
препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследования по
разработке и производству отечественных МН.
Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных
ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть
каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление
микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с
круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна
быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу
или нержавеющей стали ферментера.
Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и О2,
может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания
суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращивания на МН
применяются различные типы клеток.
Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Однако,
при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную
концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение концентрации до 3
мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью
перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет
технологический процесс.
Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в
первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для
пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10
клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток
фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до 1/3 объема
питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об/мин) на одну
минуту через каждый час в течение 4 часов, с последующим добавлением
питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации
клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной
среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала
культивирования).
Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная
среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать
оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо
проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных
типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на
цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ
(посадочная концентрация клеток 105 мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199.
Если же количество клеток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты
дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10% фетальной сыворотки.
4. ВЫРАЩИВАНИЕ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК.
В настоящее время для выделения и размножения вирусов животных
используются первичные культуры, штаммы клеток и установившиеся клеточные
линии. В общих чертах процедура оказывается одинаковой для всех вирусов.
Среду удаляют с клеточного монослоя и монослой промывают
сбалансированными буферными солевыми растворами (СБСР) или фосфатно-солевым
буфером (ФСБ) для удаления ингибиторов (антител), которые могут
присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируются в небольшом
количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30 - 60 мин.
После этого солевые растворы заменяются свежей средой.
Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает характерные
морфологические изменения клеток. Конечные дегенеративные клеточные
процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько
недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются
уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказываются различными в
случае разных вирусов.
Если вместо продуктивной инфекции вирус вызывает клеточную
трансформацию, то это также сопровождается характерными изменениями
морфологии и особенностей роста клеток.
1. ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ЗАРАЖЕННЫМИ ВИРУСАМИ КЛЕТКАМИ.
Вирусы оказывают цитопатогенное действие и служат этиологическими
агентами при многих заболеваниях человека и животных. Кроме того, многие
вирусы (например, онкорнавирусы, вирус герпеса тип II, аденовирусы, вирус
полиомы и SV40) являются, по-видимому, агентами, вызывающими развитие
опухолей у животных. Из-за способности вирусов проходить через
бактериальные фильтры бывает трудно исключить вирусы из культур
незараженных клеток при наличии вирусных суспензий, когда возможна передача
вируса через воздух культуральной комнаты.
Указанные ниже меры предосторожности носят самый общий характер и
применимы только в тех случаях, когда вирусы не представляют какой-либо
особой опасности. При использовании особо опасных вирусов, представляющих
опасность для здоровья сотрудников лаборатории или людей и животных
окружающего мира, следует применять дополнительные меры предосторожности. К
вирусам, представляющим особую опасность, относятся вирусы ньюкаслской
болезни, вирусы ящура, вирусы везикулярного стоматита, вирусы оспы, вирусы
бешенства, вирусы герпеса типа В и так далее. Кроме того, нельзя быть
уверенным, что даже такие вирусы, как SV40, не представляют опасности для
человека.
1) Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна
использоваться специальная комната или группа комнат.
2) Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не
будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры. Следует
принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих
контейнеров не были загрязнены вирусными частицами.
3) При работе с вирусами должны быть использованы специальные защитные
одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна
помещаться в специальный бак для автоклавирования.
4) Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами,
должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно
выносить из помещения, предназначенного для работы с вирусами.
5) Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специальный бак для
автоклавирования.
6) Оборудование для хранения и обработки вирусного материала должно
размещаться внутри помещения для работы с вирусами.
7) Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми автоклавами, чтобы
сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.
ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСОВ.
Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с
помощью целого ряда различных тестов, например:
1) Активность вируса измеряется путем определения количества
содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вызвать
специфическую реакцию в организме хозяина. Индуцируемая вирусом реакция
может происходить по типу «все или ничего» (т. е. наличие или отсутствие
инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью
времени, необходимого для проявления инфекции, или числом поражений в слое
чувствительных клеток. Количественное определение вирусной активности
называется титрованием.
Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответствующую
реакцию, называется инфекционной единицей, и титр исходной вирусной
суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу
объема. Например, если минимальное количество суспензии вируса гриппа,
вызывающее у мыши пневмонию при интраназальном введении суспензии ткани
инфицированного легкого в разведении 1:106 равно 0,1 мл, то это значит, что
