Культивирование вирусов
фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой
питательные среды различного состава и свойств.
Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В
составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы
обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на
поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов
в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды
фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном
монослое при размножении в клетках вирусных агентов.
Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут
входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки
животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки
естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина,
гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически
чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).
В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из
естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для
выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду
входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и
коровий эмбриональный экстракт (5%).
Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с
большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В
связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими
стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199
и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные
количества солей, аминокислот и витаминов.
Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур
конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с
достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и
Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды.
Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка
животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение
клеток и формирование монослоя не происходит.
Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред
точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных
исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее
дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих
в зависимости от серии сыворотки.
В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды
точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех
показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды
с добавлением сывороток. В связи с этим представляет интерес работа Birch
и Pirt, показавших, что для обеспечения интенсивного роста клеток в
бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей
Fe, Zn, Cu, а также МnС12.
В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для
промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно
перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500
мл среды.
Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных
питательных сред.
Среда Игла
1. л-аргинина - 17,4
2. л-цистина - 4,8
3. л-гистидина - 3,1
4. л-изолейцина - 26,2
5. л-лейцииа - 13,1
6. л-лизина - 14,6
7. л-метионина - 7,5
8. л-фенилаланина - 8,3
9. л-треонина - 11,9
10. л-триптафана - 2,0
11. л-тирозина - 18,1
12. л-валина - 11,7
13. биотина - 0,24
14. холина - 0,12
15. холин-хлорида - 0,14
16. витамина В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44
17. никотинамида - 0,12
18. пантотеновой кислоты - 0,22
19. пантотената кальция - 0,48
20. пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20
21. тиамин-хлоргидрата - 0,34
22. рибофлавина - 0,04
23. хлористого натрия - 5850,0
24. хлористого калия - 373,0
25. фосфата натрия однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0
26. кальция хлористого - 111,0
27. двууглекислого натрия (NaHCO3) - 1680,0
28. магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0
29. глюкозы - 900,0
30. л-глютамина - 146,2—292,3
31. пенициллина - 50,0
32. стрептомицина - 50,0
33. фенола красного - 5,0
34. воды до 1000,0
Приготовление.
Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80°, помешивая,
растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-
глютамин и фенол-красный.
Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за
исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим
раствором неорганических солей и добавляют биотин и витамин B12.
Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и
птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики — пенициллин и стрептомицин.
Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч
(пористая стеклянная пластина, величина пор 0,7—1,5 [pic]) либо через
асбестоцеллюлозные пластины Зейтца после предварительного промывания водой,
а затем — приготовленным раствором.
500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и
доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1 мг инозита на 1 л.
3. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.
3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.
Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in
vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первичная
культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку
не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro. В
процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры
неделящимися или медленно делящимися клетками.
На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное
удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или
ферментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 -
3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с
антибиотиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный
или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищенная)
и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры
обеспечивает высокий выход клеток.
Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани,
объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря
собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью
сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов.
Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования.
Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, мигрирующие
клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся
эксплантаты будут образовывать новые выросты.
Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного
эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.
2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК.
Как уже отмечалось выше, одним из методов получения перевиваемых
клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью роста и
размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при
регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной
клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным
клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь
на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической
смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить
бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°.
Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение
первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение
следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды.
Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°.
По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток
округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру,
и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько
удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают
появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют
разную морфологию.
В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или между
