Культивирование вирусов
Культивирование вирусов
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение....................................................................
...........................................................3
1. Виды культур
клеток....................................................................
....................................4
2. Питательные
среды.....................................................................
.....................................6
3. Получение клеточных
культур...................................................................
............…9-18
4. Приготовление первичных клеточных культур………………………................…9
5. Получение монослойных перевиваемых культур
клеток......................................10
6. Роллерное культивирование
клеток..................................................................
.....11
7. Суспензионное культивирование
клеток...............................................................13
8. Культивирование клеток на микроносителях……………………………………..16
9. Выращивание вирусов в культурах
клеток..............................................................19-24
10. Предосторожности при работе с зараженными вирусами
клетками....................20
11. Обнаружение
вирусов.................................................................
............................21
12. Культивирование пикорнавирусов на примере получения полиовируса
типа 3 в культуре клеток
HeLa...................................................................
.............24
Список
литературы..................................................................
...........................................25
ВВЕДЕНИЕ
Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему
представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток
животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные
наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и
клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным
исследованиям тканевых культур.
Большая заслуга в деле paзработки методов культивирования тканей
принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток
животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их
«бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами.
Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под
руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле
и в жидкой перемешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в
создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии
методов тканевых культур.
Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных
вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии,
достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития
до современного уровня.
Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем,
связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме
того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и
производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без
накопления вируссодержащего сырья.
1. ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК.
Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro
прекращает существование их как одного из многочисленных структурных
элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом
клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд
особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих
тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.
Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым
комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко
отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo.
В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее
культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур
тканей и клеток. Наибольшее распространение имеют однослойные, а также
суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу
современной лабораторной и производственной вирусологической практики.
Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и
перевиваемые.
Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную
непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или
постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии
определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации,
что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток,
утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они
выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и
другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной
клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и
гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием
метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-
гуморальных факторов, действующих в целостном организме.
Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации
большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и
размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in
vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам
клеток.
Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином
обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием
и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином —
полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной
продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано
с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся,
таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.
Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой
первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне
организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и
одноклеточными простейшими.
Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro
знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки
приобретают способность к автономному существованию, подобно
микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах.
Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей,
называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур —
трансформированными.
Усовершенствование техники культивирования клеток значительно
расширило возможности получения перевиваемых клеточных линий из самых
разнообразных тканей животных и человека. При этом не был обнаружен
возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации
к неограниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются
злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток
происходит in vivo в результате развития патологического процесса,
этиология которого во многом остается еще невыясненной.
Не все злокачественные новообразования способны давать начало
перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки
получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез
человека. С трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки
плоскоклеточного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравнительно
легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной
системы.
Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы,
имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты
первичных и перевиваемых клеток.
2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.
В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая
