Культивирование вирусов
стянутыми его участками появляются округленные клеточные элементы, из
которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В
культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования,
напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие
прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры
колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне
матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды.
Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является
поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона
человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются
крупные полигональные клетки с длинными отростками.
Возникшие в процессе отбора атипичные клеточные элементы должны быть
отделены от остальных участков монослоя и перенесены в отдельные пробирки
или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или
механический откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или
шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток
почек обезьяны, где колонии атипичных клеток плотно прикреплены к стеклу и
сами от него не отделяются.
При смене питательной среды в случае появления атипичных клеток
рекомендуется осторожно удалить большую часть ростовой среды, а меньшей
частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В
этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие
способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.
После переноса культуры атипичных клеток в новую посуду наблюдение за
основной культурой целесообразно продолжить, так как процесс выведения
новой клеточной линии весьма сложен, и далеко не всегда отобранные
атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток.
Необходимо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий,
продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с одними и теми же
питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.
Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки
золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного
козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).
РОЛЛЕРНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
До недавнего времени тканевые культуры применялись в вирусологии
преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях
этот метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт
показывает, что при использовании однослойных стационарных культур
встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего
времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные
культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением
полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают
благоприятные возможности для накопления клеточной массы.
Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при
котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности
горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной
средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в
отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте
культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной
культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки.
Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности,
на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого
применяли различного характера основы с большой удельной поверхностью:
твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д.
Широкого распространения эти методы не получили, так как значительно
затрудняли манипуляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С.
Ратнером и В. А. Крикуном методику многоярусного культивирования. Клетки
культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных
овальными стеклянными трубками, расположенными параллельно продольной оси
сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными
однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование
проходило в 2 этапа. На первом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной
оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки
прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном
положении. Описанная культуральная система была успешно использована для
культивирования вируса ящура.
Более эффективным оказалось вращение сосудов, в которых происходило
размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием
технического оснащения возросли объемы культуральных сосудов, и от
выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи перешли к
вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться как для
накопления клеток, так и размножения вирусов.
Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-
ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для
культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производственных
условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для
роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно.
Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть
слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не
слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе
ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения
бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для
различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах
0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после засева клеток
обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин) для
равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую
скорость вращения (20—30 об/час).
Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЭВ, ВНК-21,
HeLa, L - 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для первичных
культур - 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять 1/10, 1/20
часть объема роллерного флакона. Роллерный метод культивирования позволяет
получить большее количество клеток. Так, с флакона емкостью 3 л можно
получить урожай клеток HeLa в 8 раз, ВНК-21 - в 9 раз, АО - в 11 раз
больший, чем с монослойной стационарной культурой флакона емкостью в 1 л.
Кратность экономии сред при использовании 3-литровых флаконов составляет
для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способностью к росту и
размножению в роллерных условиях обладают субкультуры, перевиваемые
культуры и реже первичные, а также диплоидные штаммы клеток. Для лучшего
размножения клеток в роллерных аппаратах необходима адаптация их к новым
условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет
получить большие количества клеток. Преимуществом роллерных культур по
сравнению с традиционными стационарными культурами является, в частности,
более экономичное использование питательных сред и более высокий выход
вирусного антигена (на 1—2 lg).
3.4. СУСПЕНЗИОННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
В 1953 году Оуенс с сотрудниками впервые показал способность клеток
размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. С тех
пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей
в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств
клеток. Оказалось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных
типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном
состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам
культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря
постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращивания клетки
в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «урожай», чем в
стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют
неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и
анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий,
адаптируются быстрее к росту в суспензии.
Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки
отслаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток
после центрифугирования (1000 об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной
