Культивирование вирусов
среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды (реакторы,
ферментеры) и выращивают при постоянном перемешивании. В научных
исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до
10х10 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна
быть 2-5х10 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в
суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического
роста наступала не позднее 16-24 часов после приготовления культуры.
Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу,
фазу логарифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического
отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во
второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия
роста), в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается
(стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится
период уменьшения численности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза
разрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста
выражают временем генерации. Под временем генерации имеется в виду период,
необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного
выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое
должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки
во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к
стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения.
Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитными
мешалками, а также круговыми качалками. В настоящее время широко применяют
вращение флаконов и бутылей вокруг продольной оси (15-40 об/мин). На
магнитных мешалках скорость вращения составляет 100—200 об/мин. Скорость
перемешивания зависит от объема культуры; малые объемы культуры требуют
невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах.
Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда
производят силиконирование. Силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности
препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.
Внутренние стенки культурального сосуда смачивают 5% или 10%-ным
раствором силикона и после испарения растворителя (бензолового,
ацетонового) сосуды выдерживают при 85°С и 200° (соответственно в течение
30 и 60 мин). После охлаждения сосуды наполняют горячей бидистиллированной
водой и оставляют на 2 часа, затем их 3 раза ополаскивают
бидистиллированной водой и высушивают при 100°С. Сосуды стерилизуют в
сушильном шкафу при 170°С в течение 2 часов.
Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2.
Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не
отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в
однослойной культуре. Чаще всего при культивировании клеток в суспензиях
берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов.
Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем
монослойные. В процессе потребления глюкозы клетки выделяют в среду
токсичную для них молочную кислоту. Потребление клетками глюкозы и
выработка молочной кислоты идут параллельно и находятся в прямой
зависимости от плотности клеточной популяции. Полезным оказалось
прибавление к питательной среде инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1
л. Прибавление к питательной среде инсулина изменяет соотношение между
количеством поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для клеток
линии L указанный коэффициент может быть снижен с 74-81 до 37-38%.
Различные аминокислоты потребляются из питательной среды растущими
клетками с неодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное прибавление
аргинина (20-40 мг/л) и увеличение количества глутамина до 450 мг/л
благоприятствуют росту взвешенных культур.
Прибавление инозитола (0,4 мг/л) позволяет ускорить рост культур
амниотических клеток человека. Желательным является добавление к среде
каталазы (1 мг/л) и тироксина (12 мг/л).
Большой интерес представляют работы, посвященные получению взвешенных
культур клеток в синтетической среде, не содержащей сыворотки крови.
Предпринимаются попытки увеличить вязкость питательной среды за счет
безбелковых ингредиентов. С этой целью используется метил-целлюлоза и
гиалуроновая кислота.
Метилцеллюлоза в концентрации 0,1-0,2% обладает максимальным защитным
действием на взвешенные в среде клетки. Протективное действие
метилцеллюлозы заключается в том, что молекулы образуют защитный слой
вокруг клетки, предотвращающий повреждение клеток при перемешивании среды.
Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является
парциальное давление кислорода в жидкой фазе. Концентрация кислорода в
газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже
атмосферной. Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы,
клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода
клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся
очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода. Оптимальная
концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах
от 9 до 17% или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20%
происходит ингибиция клеточного роста. Так, при концентрации кислорода 24%
размножение клеток почек эмбриона кролика (линия ERK) снижалось наполовину,
а при 30% сводилось к нулю. Повышение концентрации кислорода токсически
воздействует на клеточный метаболизм.
Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концентрации
клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питательной среды,
способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.
Однородность суспензии, возможность длительного поддержания клеток в
логарифмической фазе роста, перспективы математического моделирования
процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов внешней среды,
удобство многократного исследования физиологического состояния культуры
клеток в суспензии, высокая экономичность метода -вот далеко не полный
перечень преимуществ суспензионных культур.
Суспензионные культуры широко используется в вирусологических
исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего
материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.
3.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ.
В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий
элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он
назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки
прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц
«микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью
перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром
160—230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл
среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом
общая площадь их составит от нескольких до 50 см2/мл.
Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности
частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной
частице.
Основными преимуществами этого метода являются:
1) создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает
возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.);
2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1
мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4)
введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста
контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией
культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7)
возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при
низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные
концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования
культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций
микроносителя.
Микроносители должны иметь:
- небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В связи с
тем, что большинство клеток животных имеют слабо отрицательный заряд, они
легче будут прикрепляться к такому МН:
- плотность 1,05—1,15 г/см; указанная плотность является оптимальной
для поддержания МН во взвешенном состоянии;
- диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста
