Регистрация сигнальных молекул
ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как
ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и
для очистки воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот,
фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду
кислородом. Употребляются и человеком.
За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный
экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и
биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым
размерам, быстрому росту, что позволяет использовать всего один
генетический клон на протяжении всего эксперимента.
1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК
Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы
посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA
и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные
моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически
поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений
являются ----------- и довольно широкий круг производных -------
биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников
лигнина.
Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев
двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как -----
и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные
ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая
активность у большой группы ------- соединений растительной природы.
Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких
сигнальных соединений. Известно, что ------------ и коричная кислоты,
проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными
свойствами и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза -------.
---------- распознаются специфическими рецепторами агробактерий,
являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к
таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов
vir требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов:
глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты,
арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты
клеточной стенки растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим
доменом рецептора в виде предварительно обработанного комплекса с белком-
продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат
индукции процессинга тДНК зависит от синергической активности сигнальных
соединений и сахаров эксцудатов растений.
Структурная формула:
Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию
генов vir -----, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно
ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и
трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный
хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G,
который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора
собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----.
Механизмы активации следующие.
Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении
сигнальных молекул автофосфорилируется --------- на своем С-конце, переходя
в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A
взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).
Активированный белок vir A в свою очередь --------- внутренний клеточный
белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al.,
1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных
генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве
транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад
реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если
хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не
осуществляется [Hess et al., 1991].
Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-
плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также
хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного
хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов
экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.
3. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для
горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.
2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм: |Escherichia coli
HB 101
Agrobacterium tumefaciens
C58C1 | |Плазмиды: |рGV3850 | |тДНК: |рBR322 маркер Ар, Тс | |
2.1.3. Растения
В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное
однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).
Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре
18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в
теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани
листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а
затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в
экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты
двудольные растения табака красного и льна долгунца.
2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений
В работе использовали среды:
Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
NaCl
Дрожжевой экстракт
Бантотриптон |10 мг/л
5 г/л
5 г/л | |рН 7,5
Температура 240 С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
LB
штамм |10 мл
1 мл | |Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена
в таблице.
2.1.5. Другие растворы
Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10
мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.
Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл.
Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.
2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии
Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.
2.1.7. Антибиотики
Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.
Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений
Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном
шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в жидкой среде LB, собирали
центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН
5,5) до кислотности А600 – 0,05.
После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные
стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды
и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с
добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве
отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные
на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации
агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после
инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных
разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов
проводили в трех повторностях.
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens
ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов
совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок
удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g.
Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин
при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА),
содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды
экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и
растворяли в ТЕ–буфере.
2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну
В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия
в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в
лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение
2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5
мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса
использовали ДНК фага (, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind
III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда
использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной
системы.
2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli
