Регистрация сигнальных молекул
Регистрация сигнальных молекул
содержание
| |СТР. |
|СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ | |
|ВВЕДЕНИЕ | |
|1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ | |
|1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ TI-ПЛАЗМИД АГРОБАКТЕРИЙ В ГЕНЕТИчЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ | |
|1.1.1. КРАТКАя ХАРАКТЕРИСТИКА AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |
|1.1.2. CОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ TI-ПЛАЗМИД | |
|1.1.3. ПРОЦЕССИНГ ТДНК В БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ | |
|и ее перенос в клетки растений | |
|1.1.4. Разработка система трансформаций растений с | |
|помощью Agrobacterium tumefaciens | |
|1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, | |
|перенесенных в растение | |
|1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных | |
|растениях | |
|1.2. Использование метода генетической | |
|инженерии для трансформации однодольных растений | |
|1.2.1. Краткие характеристики ряски | |
|1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг | |
|тДНК | |
|2. Материалы и методы | |
|2.1. Материалы | |
|2.1.1. Оборудование | |
|2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды | |
|2.1.3. Растения | |
|2.1.4. Среды микробиологические для | |
|культивирования растений | |
|2.1.5. Другие растворы | |
|2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии | |
|2.1.7. Антибиотики | |
|2.2. Методы | |
|2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с | |
|экссудатами тканей растений | |
|2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens | |
|2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну | |
|2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli | |
|3. результаты | |
|4. обсуждение | |
|5. выводы | |
литературы | | |приложение | | |
СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы:
Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений
корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-
156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий
опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического
материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая)
перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь
частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в
трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный
баланс и определяют синтез специфических ------- соединений.
Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами",
осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос
генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные
векторные системы для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса
взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом
процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых
сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей
растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir
(агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос
в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого
круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у
весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин
ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается
присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и
перенос тДНК.
Цель работы:
В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких
сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной
работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул,
индуцирующих процессинг тДНК.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии
растений
1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений
достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы
генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия
чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития
генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых
образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae)
характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-
плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а
так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo
необходимо повреждение тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии
переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее
стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же
вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном
кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-
области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном
в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,
характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по
гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-
плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за
опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе
ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует
изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-
монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня
фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является
повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК
кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин
и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров,
которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом,
образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный
пример генетической инженерии растений в природе.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках
агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности
микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны.
На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные
мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах.
Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как
хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое
связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную
локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие
экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам
растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное
взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два
связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и
5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются
конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей
получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации
в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не
