Регистрация сигнальных молекул
все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного
на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В
случае индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный
элемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной
клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут
претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями.
Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь
тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке.
Обсуждается, что в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens ---
----- полуконсервативной репликации тДНК вторая цепь может в процессе
переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой
цепи.
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens
Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации
растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных
клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для
сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо
целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или
карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.
В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных
маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число
трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными
протопластами либо с эксплантантами листьев. Было показано, что
кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными -----
---, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al.,
1981]. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации
растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные
селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных
культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны
только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из
протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко
преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо
протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].
Стерильные листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе
обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к
антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках
со средой для образования побегов. После этого их переносят на среду с
цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком
(например, с ---------) для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги
дают корни, после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших
экспериментов.
Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное
сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой ------- и
регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих
лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода.
Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было
предложено обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S,
1987], который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако
метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех
видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных
клеток в месте поранения.
Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются
конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986],
клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами
[Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987].
Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для
арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с
культурой ткани.
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение
Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных
методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с
законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области
ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному.
Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах
животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный
подход был успешно применен для трансформации растений [Paszkowski et al.,
1988].
В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один
локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было
показано с помощью гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Однако,
часто наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных
хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. В связи с этим во многих случах была получена
контрансформация физически несцепленных генов, сегрегация некоторых
проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности
при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайную потерю
трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (например, при
метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы,
например, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по
неменделевскому типу наследования – по материнской линии.
Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа
трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто
наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий
чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты [Krens
et al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить
рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986;
Wirtz et al., 1987]. Образование инвертированных повторов является основным
типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК ---
-- Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].
Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать
во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным
модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако, и после интеграции
могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза
[Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление
тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и
фенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками.
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях
Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в
растениях используют множество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et
al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981]. Кроме
того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к
антибиотикам и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов,
как cat, npt II, гены октопин- и -------- разработаны чувствительные методы
[Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого рода анализ может иметь большое значение, поскольку можно
комбинировать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими
регуляторными последовательностями растительных генов, либо создавать
двойные гены, экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность
гена и промотора можно таким образом определить либо с помощью
ферментативного анализа, либо гибридизацией растительной РНК с зондами,
комплементарными репортерному гену.
Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для
анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, в частности,
генов устойчивости к гербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.
1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на
всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной
Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются
самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко
превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней
степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строения
занимают первое место среди цветковых.
Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние
травянистые растения. По своей природе рясковые являются неотеническими
формами произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из
семейства Ароидных. Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так
же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и
