RSS    

   Регистрация сигнальных молекул

для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического (-D-

гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки

с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального (-D-гликана в инфекционном

процессе еще точно не установлена. Помимо циклического (-D-гликана в

прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают

участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.

Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и

Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb,

проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также

гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами

конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано

шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в

единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет

дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas

et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D

придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства

хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной

клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном

растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но

и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных

репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и

успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической

инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК

из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее

переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми

границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК

размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti-

и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид.

В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный

разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона,

происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает

сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.

Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку

особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность

переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии

полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же

как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.

На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и

vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации

в генах vir B и vir D – оперонов.

1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид

В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести

чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью

транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-

специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с

Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].

Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации,

занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с

очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные

векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить

селекцию и регенерацию трансформатов.

Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных

генов в растения с помощью Ti-плазмид:

---- векторы

бинарные векторы.

В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не -------

для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между

границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и

нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В --------

векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность

pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения,

нужно проклонировать в этом же векторе.

Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть

перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним

из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850

[Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез

фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.

ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми

производыми pBR, несущими клонированный ген.

Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных

растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана

система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322

из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее

время сконструированы и успешно используются и другие --- ----------

векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].

Рис. 2.

Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область

вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может

происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB –

левая и правая границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ –

маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику

для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов

при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало

репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.

Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir

могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких

системах обычно присутствуют два элемента:

Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида

несет в своем составе гены vir, действующие in trans.

Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные

гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими

последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис

Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку

нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena,

Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в

готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке

и ее перенос в клетки растений

Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens

с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами

или в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные

молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,

двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут

претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в

растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся

за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с

образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых

количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в

то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение

репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к

появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование

прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить

сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить

возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-

плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах.

Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на

второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование

двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств

линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток

в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после

добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ---

------ в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма

процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].

Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после

добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении

последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль,

показывая, что процесс лимитирован.

Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную

клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения

относительного количества каждой из форм и выявления динамики их

превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени

и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в

месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5


Новости


Быстрый поиск

Группа вКонтакте: новости

Пока нет

Новости в Twitter и Facebook

                   

Новости

© 2010.