Регистрация сигнальных молекул
для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического (-D-
гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки
с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального (-D-гликана в инфекционном
процессе еще точно не установлена. Помимо циклического (-D-гликана в
прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают
участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и
Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb,
проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также
гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами
конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано
шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в
единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет
дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas
et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D
придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства
хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной
клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном
растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но
и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных
репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и
успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической
инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК
из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее
переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми
границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК
размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti-
и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид.
В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный
разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона,
происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает
сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку
особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность
переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии
полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же
как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и
vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации
в генах vir B и vir D – оперонов.
1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид
В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести
чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью
транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-
специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с
Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].
Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации,
занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с
очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные
векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить
селекцию и регенерацию трансформатов.
Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных
генов в растения с помощью Ti-плазмид:
---- векторы
бинарные векторы.
В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не -------
для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между
границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и
нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В --------
векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность
pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения,
нужно проклонировать в этом же векторе.
Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть
перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним
из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850
[Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез
фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми
производыми pBR, несущими клонированный ген.
Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных
растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана
система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322
из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее
время сконструированы и успешно используются и другие --- ----------
векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область
вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может
происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB –
левая и правая границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ –
маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику
для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов
при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало
репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.
Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir
могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких
системах обычно присутствуют два элемента:
Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида
несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные
гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими
последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку
нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena,
Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в
готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens
с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами
или в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные
молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,
двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут
претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в
растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся
за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с
образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых
количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в
то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение
репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к
появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование
прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить
сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить
возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-
плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах.
Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на
второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование
двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств
линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток
в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после
добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ---
------ в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма
процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].
Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после
добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении
последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль,
показывая, что процесс лимитирован.
Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную
клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения
относительного количества каждой из форм и выявления динамики их
превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени
и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в
месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда
