Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс
последовательному уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после
двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще
(рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением
внутриклеточных депо.
[pic]
1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином
(спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума)
уменьшало [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63% ( 5%
для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11
приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca2+ в клетке.
1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации
100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i
транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15%
сответственно. Данные представлены на рисунке 12.
[pic]
1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по
амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для
данного объекта был следующим ATP(S ( ATФ ( AДФ (( (,(-methylene ATP
( AMФ ( УТФ(( аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.
[pic]
1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал
[Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 7% и
также не изменял концентрацию [Ca2+]i в покое. Данные представлены
на рисунке 14.
[pic]
ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их
способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать
вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является
доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные
приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды
[Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод об отсутствии
десенситизации данного типа рецепторов.
Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что
АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы
потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и
верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% -
15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал -
управляемых каналов.
Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы
прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом
уменьшалась на 45% ( 7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные
депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок
к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+
ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо
полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция
мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы
эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63% ( 5%
в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых
рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения
уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо
происходит по IP3 - чувствительному механизму.
В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих
пуринорецепторов. Построив ряд активности агонистов для Р1 и Р2
пуринорецепторов по амплитудам ответов, мы сделали заключение базирующееся
на отсутствии ответа на аденозин, что в нашем объекте присутствуют только
Р2 пуринорецепторы. Проводя дальнейшую субклассификацию Р2 типа рецепторов
мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р2х и Р2у рецепторов.
Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзинета вызванного
приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 5%, что говорит о наличии этих типов
рецепторов в исследуемом объекте.
ВЫВОДЫ
1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca2+ транзиенты в
клетках моторной коры крыс.
2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в
220 нМ.
3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения
внутриклеточного кальция.
4. В генерации АТФ индуцированного повышения [Ca2+]in принимают участие
некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов.
5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP3 чувствительных
депо.
6. В данном объекте присутсвуют только Р2 подтипы пуринорецепторов.
7. Сурамин - антагонист Р2Х2 и Р2Х5 и Р2У рецепторов уменьшает амплитуду
[Ca2+]in транзиенты, что говорит присутствии некоторых из
вышеперечисленных рецепторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced
calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology
(London), 489.3 627-636.
2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-
induced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root
ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7,
Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.
3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995):
“Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory
neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111.
Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.
4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk &
A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive
intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology
/Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25.
5. A.Verkhratsky, A. Shmigol, S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk
(1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium
homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy
of Sciences, v. 747, p365 - 381.
6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there
families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445-475
7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of
caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult
DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076.
8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey
Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+
stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers
Arch v.426, 174-176.
9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969)
The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol.,
Lond. 200, 431-458.
10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated
ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 - 90.
11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp
in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond.
462, 47 - 58.
12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation.. New York: Wiley-
Liss.
13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA
cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third
organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561-18568.
1. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581
1. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of
purinergic receptor. in: book
1. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7-33
14. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing
two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433-440
15. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev.
71, 129 - 153.
16. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed
by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431
17. Кришталь О.А., Марченко С.М. (1983). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах
млекопитающих. Докл. Акад. Наук УССР.
18. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992)
Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF-b,
Science, 257, 91 - 94.
19. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5 andP2X6 receptors and the
distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion
channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507
20. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate.
Biochem.J. 233: 309-319
21. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+
indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol.
Chem., 260, 3440-3450, 1985.
22. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium-binding
