Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс
увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее
использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем
случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана
длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е.
флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от
концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.
Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет
легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):
[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)
где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием,
R=F360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin =
F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca2+,
Rmax = F360/F390|CaҐ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией
Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и
высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры
Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены
базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 -
0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с
добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2
- 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных
выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате
для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из
работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.
3 Окраска срезов флуоресцентным красителем
Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы
инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную
незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5
мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента
Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем
эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится
заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при
температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования
окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный
раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в
диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.
4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения
концентрации кальция
Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными
элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп,
ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.
Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт.
Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор
Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для
количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно
индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации
периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи
вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами
360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены
фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы
Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом
предварительной обработки.
Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа
Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции
производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через
фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и
при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75)
фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через
соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный
умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1
мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал
собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно
улучшить соотношение сигнал/шум.
Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию
автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он
оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался
компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в
Гейдельберге, Германия.
[pic]
Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для
двухволнового измерения кальция.
5 Растворы и смена растворов
При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде
(в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26,
KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2
+ 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой
CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием
калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или
кофеина.
Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было
варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял
0.5 мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 (С).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
[pic]
Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102)
вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного
кальция [Ca2+]i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума на
протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при
продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению
[Ca2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого
транзиента представлен на рисунке 5.
[pic]
Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в
пределах от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i вызванного
приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ.
Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в
пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация
экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой
амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 ± 20 мкМ.
[pic]
Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов
вовлеченных в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ активирует
несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2 пуринорецепторы подтипов Р2х
и Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+
каналы плазмалеммы (Кришталь, 1983).
С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во
внимание тот факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы
провели серию экспериментов с подавлением распостранения потенциалов
действия с помощью тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось,
что амплитуда и форма [Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется
незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что
получаемые нами данные отображают процессы происходящие в отдельной
наблюдаемой клетке. К сожалению мы не имели возможности проводить все
эксперименты c тетродотоксином из-за дороговизны препарата. Для изучения
характеристик рассматриваемых пуринорецепторов, принимающих участие в
генерации [Ca2+]i транзиента, применялись следующие протоколы
экспериментов.
1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из
внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент,
вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% ±
7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).
[pic]
1. Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к
перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с
интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем
Ca2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+
транзиент меньшей (на 30% ( 4%) амплитуды по сравнению с первой
(контрольной) аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60
ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды
[Ca2+]i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном
растворе
[pic]
В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала
значительное уменьшение Ca2+ транзиента на 40% ( 5% от контроля.
Последующие аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к
