Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс
четвертой - 6,5 (Ленинджер, 1976). Таким образом, при pH 7,4 подавляющее
большинство молекул АТФ представляют собой четырехзарядные анионы АТФ4- ,
кроме того, в растворе присутствует небольшое количество АТФ3-.
2 Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов.
Первое разделение пуринорецепторов на Р1 и Р2 типы основывалось на
следующем критерии: нуклеозиды такие как аденозин активировали Р1
пуринорецепторы, в то время как АТФ стимулировала Р2 пуринорецепторы, а
метилксантины (кофеин, теофиллин) являются селективными антагонистами Р1
пуринорецепторов. Также Р1 пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой, а
активация Р2 пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов
(Burnstock 1978).
3 Р1 пуринорецепторы.
В 1979 году (Van Calker et al 1979) показали, что аденозиновые, Р1 -
пуринорецепторы можно подразделить на две группы. Рецепторы одной из них
обладали очень высоким сродством к аденозину (константа диссоциации Кd = 3 -
10 нМ). При взаимодействии аденозина с этой группой рецепторов наблюдалось
ингибирование аденилатциклазы и, следовательно, уменьшался уровень
внутриклеточного цАМФ. Этот класс рецепторов был назван А1 -рецепторами (Ri
рецепторы по (Londos et al 1980)). Аденозиновые рецепторы, относящиеся ко
второй группе, имели более низкое сродство к аденозину (Кd комплекса
аденозина с рецептором 5-10 мкМ). Активация этого типа рецепторов приводила
к стимуляции аценилатциклазы. Эти рецепторы Ван Колкер назвал А2-
рецепторами (Ra рецепторы по (Londos et al 1980)). Были обнаружены также и
мощные антагонисты для А1 - R-N6-Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А2
более сильным антагонистом был 5’-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Также
существуют работы, в которых описываются аденозиновые рецепторы, не
связанные с аденилатциклазой эти пуринорецепторы было предложено назвать А3
(Ribeiro and Sebastiao 1986). Предпосылкой к разделению А2 пуринорецепторов
на А2а и А2b подтипы стало открытие разного сродства NECA к Р1
пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и низкого в фибробластах
(А2b) (Bruns et al 1986).
4 Р2 пуринорецепторы
Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок
активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными
аналогами, послужили основой для первого субделения Р2 пуринорецепторов. В
1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность популяции Р2-
пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того, что в некоторых
тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал расслабление
гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) - сокращение.
Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй - Р2х. Для Р2х
пуринорецепторов наиболее активным агонистом был (, ( - метилен АТФ ((,(-
мАТФ), а для Р2у - 2 - метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности
лигандов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений,
которая может значительно различаться в зависимости от ткани, более четким
доказательством для подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие
селективных блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для
Р2х, так и Р2у-рецепторов для Р2х - (,(-мАТФ (десенситизирующее действие),
арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3), пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-
дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и другие; для Р2у пуринорецепторов -
реактив голубой 2, сурамин. В 1986 году Гордон (23) предложил выделить из
класса Р2 пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z. Первый рецептор
располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в отличие от
всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется АДФ, и блокируется
АТФ. Р2z рецепторы расположены в тучных клетках. В них АТФ в очень больших
концентрациях (> 100 мкМ), а точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал
кальцийзависимую секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая
негидролизуемые аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен
неселективный антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS
(Soltoff et al 1993). В 1991 году O’Connor предложил так называемый
нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но
не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот рецептор получил обозначение Р2u.
Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин. Также было
обнаружено, что аденин динуклеотид полифосфаты также присутствуют в
фармакологической периферии (Hoyle 1990). Hildermann (1991)
индентифицировал сайт связывания для диаденозин тетрафосфата ( Ap4A) в
мозге крысы, который получил название дипуринергического рецептора, а
позднее Р2d (Pintor et al 1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов
пока не обнаружены.
|пуринорецепторы |
| | |
|Р1 - пуринорецепторы | |Р2 - пуринорецепторы |
| | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|A1 | |A2a |A2b | |A3 | |P2x | |P2y | |P2t| |P2z| |P2u | |P2d |
Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.
5 Реклассификация пуринорецепторов.
Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме
классификации Р2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов
рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует пересмотра. В
1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р2
- пуринорецепторов. Из всех Р2 - пуринорецепторов они вычленили три
основных семейства: Р2Х семейство, связанное с ионотропными каналами,
которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с активацией G - белков,
включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство неселективных пор. Их
гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и
анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В дальнейшем
теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2 -
пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У
- семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не
остается сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo
et al 1996).
|Р2 - пуринорецепторы |
| | | |
| |P2Z - неселективные поры | |
| | | |
|Р2Х - семейство | |Р2У - семейство |
|ионотропных | |метаботропных |
|рецепторов | |рецепторов |
| | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | |
|Р2Х1|Р2Х2|Р2Х3|Р2Х4|Р2Х5|Р2Х6|Р2У1|Р2У2|Р2У3|Р2У4|Р2У5|Р2У6|Р2У7|
Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1 Подготовка препарата
Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области
новой коры в тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После
декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура
от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд.
Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома
(Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась
холодным солевым раствором. Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300
мкм; скорость подачи лезвия - 1 см/с с частотой 10 Гц. После приготовления
срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95%
О2). Перед загрузкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в
постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса.
Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном
термостате при температуре 35 градусов. После окраски срезы отмывались 1 -
1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все
эксперименты проводились при температуре 32 градуса.
2 Характеристики кальциевого зонда
[pic]
Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных
нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM
(рисунок 2) (16).
[pic]
На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с
кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого
красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит
уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм -
