Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс
саркоплазматические Са2+ каналы кардиомиоцитов не связаны с плазмалеммой, и
для стимуляции освобождения Са2+ из депо требуется увеличение концентрации
цитозольного кальция (RyR2-тип). ДНК, кодирующая белки двух типов каналов
Са2+ освобождения, была клонирована из тканей человека и кролика, что дало
возможность экспрессировать Са2+-управляемые Са2+ каналы в модельные
клеточные системы. Белки, встроенные в липидный бислой, формируют
чувствительные к рианодину каналы, активируемые ионами Са2+ (50 нмоль/л) в
присутствии АТФ (29). Кроме этих двух типов Са2+-активируемых Са2+ каналов,
недавно был идентифицирован третий тип Са2+ каналов ЭР (RyR3-тип), который
является продуктом другого гена. Этот третий тип Са2+ каналов ЭР, как было
показано, не чувствителен к кофеину (21). Эксперименты, проведенные на
нервных тканях, продемонстрировали присутствие всех трех типов Са2+-
управляемых Са2+ каналов ЭР в мозге млекопитающих, однако RyR2-тип является
доминантным (38). Са2+-управляемые Са2+ каналы ЭР являются гомотетрамерами,
состоящими из мономеров с молекулярным весом 500 КД (39)
IP3-управляемые Са2+ каналы ЭР. Существование IP3-управляемых Са2+
каналов впервые было обнаружено в нейронах Пуркинье. Позже было показано,
что они встроены в мембрану эндоплазматического ретикулума. Структура IP3-
управляемых Са2+ каналов сходна со структурой Са2+-управляемых Са2+ каналов
ЭР. Они также являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономера 260
КД. 50% этих каналов активируется 15 мкмоль/л IP3 и блокируется рутением
красным и La3+. IP3-управляемые Са2+ каналы были выделены из мозга
млекопитающих, и их аминокислотная последовательность была расшифрована.
Было показано, что семейство генов, экспрессирующих IP3-управляемые Са2+
каналы, состоит из трех или четырех различных генов; они характеризуются
различной чувствительностью к IP3 и по-разному распределены в мозге
млекопитающих (45). Порог активации этих каналов варьирует между 0.2 - 0.5
мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9 мкмоль/л в
астроцитах.
4 Кальциевые насосы
Существует два семейства Са2+ насосов, ответственных за устранение
ионов Са2+ из цитоплазмы: Са2+ насосы плазмалеммы и Са2+ насосы
эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному семейству
белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают некоторые
различия в строении, функциональной активности и фармакологии.
Кальциевый насос плазмалеммы. Са2+ насос плазмалеммы, который удаляет
ионы Са2+ из цитоплазмы в межклеточное пространство, был открыт в 1966
году. Молекулярные свойства Са2+ насосов плазмалеммы описаны в нескольких
обзорах (18), однако достоверных данных о скорости вывода Са2+ и регуляции
Са2+ насосов в нервных клетках немного. Недавно был разработан
двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58), позволяющий одновременно
измерять [Ca2+]i и выход Са2+ наружу на одиночных клетках. Исследования,
проведенные с помощью данного метода на нейронах моллюска и секреторных
клетках, показали, что активность Са2+ насоса плазмалеммы контролируется
непосредственно [Ca2+]i: увеличение концентрации цитоплазматического
кальция активирует Са2+ насос (58). В нейронах моллюска около 40% ионов
кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится из
нейрона уже во время фазы нарастания [Ca2+]i, отражая таким образом
активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации
цитозольного Са2+ (58).
Кальциевый насос эндоплазматического ретикулума. Во многих
эукариотических клетках, наряду с Са2+ насосом плазмалеммы, существует
кальциевый насос сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA). В настоящее
время описано по крайней мере 3 различных изоформы SERCA-насосов в клетках
млекопитающих. SERCA1-подтип сосредоточен исключительно в быстрых скелетных
мышцах, SERCA2-насосы широко распространены в других тканях. Значимость
SERCA3-насосов менее ясна (13). Белки SERCA2-насосов разделяются на две
различные изоформы: SERCA2а, характерные для кардиомиоцитов и гладких мышц,
и SERCA2b, характерные для тканей мозга. Предполагается, что насосы SERCA
различными способами регулируются цитоплазматической и интралюминальной
концентрациями Са2+: Увеличение [Ca2+]i активирует захват ионов кальция в
ЭР, в то время как увеличение свободного кальция внутри ЭР ингибирует
насосы SERCA (12). Насосы SERCA эффективно и селективно блокируются
тапсигаргином в наномолярных концентрациях (37) и микромолярными
концентрациями циклопиазоновой кислоты. Однако, тапсигаргин вызывает также
блокаду потенциал - управляемых кальциевых каналов плазмалеммы, как это
показано на клетках коркового слоя надпочечников и на сенсорных нейронах
(Shmigol et al., 1995), поэтому его следует использовать с некоторой
осторожностью.
5 Кальциевые обменники
Дополнительным механизмом, ответственным за вывод ионов кальция из
цитоплазмы, является натрий-кальциевый обменник, который выводит Са2+,
используя энергию натриевого электрохимического градиента. Наличие Na+-
Са2+ обменника было показано в различных типах возбудимых и невозбудимых
клеток; в клетках нервной системы он был обнаружен в конце 60-х годов (9).
В нейронах моллюска, помещенных в среду с пониженным натрием (т.е. с
обратным натриевым градиентом), наблюдалось увеличение [Ca2+]i, что
является результатом работы обменника в инвертированной форме. Однако,
вклад Na+- Са2+ обменника в регуляцию [Ca2+]i в нейронах млекопитающих до
сих пор не оценен. В некоторых работах было показано, что обменник
принимает незначительное участие в удалении цитоплазматического Са2+, в то
время как в других работах представлены данные о том, что обменник играет
существенную роль в переносе Са2+ через мембрану (57).
6 Са2+-связывающие органеллы
Кроме быстрого связывания цитозольного Са2+ внутриклеточными Са2+-
связывающими белками, ионы кальция, попадающие в цитозоль, могут
аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром, захватываться
митохондриальными Са2+ депо, имеющими достаточно невысокое сродство к Са2+,
или быстрыми депо, связанными с ЭР или СР, имеющими высокое сродство к
Са2+. Однако если [Ca2+]i превышает 0,5 мкмоль/л, наблюдается существенное
перераспределение [Ca2+]i в область митохондрий. Буферные системы
митохондрий принимают участие в удалении избыточного Са2+ из цитоплазмы в
клетках кишечника, некоторых типах нервных клеток (59) и в секреторных
клетках после повышения [Ca2+]i, стимулированного агонистами. Связывание
кальция митохондриями обеспечивается активностью систем, расположенных на
внутренней митохондриальной мембране. Са2+ поступает в митохондрии по
электрохимическому градиенту; разность потенциалов, обеспечивающая
транспорт кальция, создается переносом электронов во время клеточного
дыхания и связанного с ним переносом протонов. Перенос электронов по
дыхательной цепи является основным механизмом, обеспечивающим энергетику
транспорта кальция. Подавление дыхательной цепи карбонил-цианид-м-
хлорофенил-гидразоном (СССР) эффективно блокирует аккумуляцию кальция
митохондриями (41).
2 Влияние АТФ на кальциевый гомеостаз
Последние исследования показали, что АТФ занимает прочное место в ряду
нейромедиаторов центральной и периферической нервной систем (Burnstock
1990). Не вызывает сомнения, что АТФ является не только важнейшим
внутриклеточным метаболитом, но и служит важным объектом межклеточного
взаимодействия.
1 Строение и свойства АТФ
[pic]
АТФ (см. рис.1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит
из трех компонентов: азотистого основания, сахара пентозы и фосфата. В
качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина
и пиримидина. Фосфаты соединены в полифосфатную цепь, количество которых в
естественных нуклеотидах не превышает трех. Однако синтезированы
нуклеотиды, содержащие линейные цепи из более чем 3-х фосфатов, к примеру
аденозинтетра- и аденозинпентафосфаты.
Названия нуклеотидов, содержащих в качестве сахара рибозу, складываются из
названия соответствующего нуклеозида, приставки, обозначающей количество
фосфатных групп в нуклеотиде и слова фосфат. Для наиболее распространенных
нуклеотидов приняты сокращенные названия, например АТФ для
аденозинтрифосфата, ГТФ - для гуанозинтрифосфата, ИМФ - инозинмонофосфата.
В области нейтральных значений pH нуклеиновые основания и рибоза в
растворе не заряжены (Мартин, Мариам, 1982). Нуклеотиды, из-за наличия
фосфатов, представляют собой сильные кислоты. АТФ содержит четыре ОН
группы, способные к ионизации, три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa