Биологическая характеристика возбудителей вирусных трансфузионных гепатитов
[1 ].
В 1970 году Дейн описал большую более сложную частицу, содержащую
HBsAg. Она представляет собой полный вирион HBV, диаметром 42 нм, имеет
липидосодержащий наружный слой (оболочку) толщиной 7 нм и электроноплотную
сферическую внутреннюю сердцевину (нуклеокапсид) диаметром 28 нм.
Поверхность вириона имеет антигенные детерминанты HBsAg, общие с неполными
формами вируса. Наружная оболочка удаляется обработкой неионными
детергенами, такими как NP-40, после чего остаются сердцевинные частицы,
содержащие HBсAg, химически отличающиеся от HBsAg. Сердцевина вируса
содержит также вирусную ДНК с ковалентно присоединенным полипептидом,
протеинкиназу и третий антиген, ассоциированный с инфекционностью HBV –
(HBeAg), присутствующий в скрытой форме [5,15].
Введение шимпанзе 1 мл некоторых неразведенных HBsAg реактивных
сывороток, полученных от больных с хроническими HBV, после антивирусной
терапии, не вызвало у них инфекции. Вывод: у таких больных HBsAg
циркулирует только в составе неполных частиц, но не в составе полных
вирионов. Однако, сыворотки некоторых больных были заразны в разведениях 10-
7 [ 2,12 ].
1.2.2 Структура HBsAg.
Это сложный антигенный комплекс. В этих частицах может определятся пять
антигенных детерминант.
Группоспецифическая детерминанта а – общая для всех препаратов HBsAg.
Еще есть две пары подтиповых детерминант: d или y, или w, или r –
взаимоисключающие друг друга. Описаны антигенная гетерогенность w –
детерминант и добавочные детерминанты, такие как q или x или g [15,7].
Идентифицировано 8 подтипов HBsAg: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4,
adr [11]. Необычные комбинации подтипов детерминант выделяются на Дальнем
Востоке. Наблюдается неравномерное географическое распределение подтипов
HBsAg среди зараженного населения. В Северной Америке, Европе и Африке
преобладают подтипы adw и ayw, а в Юго – Восточной Азии и на Дальнем
Востоке – подтип adr на ряду с adw и ayw. Подтип ayr менее распространен в
мире, но он идентифицирован у нескольких изолированных групп населения
Океании [15,3].
Доказано, что вирус – специфическим антигеном является HBsAg,
иммунизация которым обеспечивает защиту от HBV.
Для определения х/с HBsAg сферические нитевидные частицы можно очистить
гельфильтарцией, скоростным зональным центрифугированием в градиенте
плотности CsCl. При центрифугировании в градиенте плотности CsCl эти
частицы отделяются от вируса благодаря различиям в их плавучих плотностях.
Плавучая плотность (22 нм) – сферических частиц подтипов adw и ayw равна
1,20 г/см3 в CsCl и 1,17 г/см3 в сахарозе. Это свидетельствует о
значительном содержании в них липидов приблизительно 30%. Более высокая
плавучая плотность полных вирионов приблизительно 1,28 г/см3 для вирионов с
нуклеокапсидом, содержащем ДНК и 1,24 г/см3 для вирионов с пустой
сердцевиной, отражает вклад нуклеиновой кислоты в нуклеокапсиды. Липидный
анализ дает смесь липидов[5,7,3,15].
Средняя молекулярная масса HBsAg / adw равна 3,7*106 - 4,6*106. при
изоэлектрическом фокусировании препаратов (22 нм) – частиц HBsAg выявляется
несколько популяций с различными значениями pI от 3,65 до 5,3. Средний
коэффициент сидиментации для HBsAg варьирует от 39 S до 54 S. Определение
среднего удельного коэффициента экстинкции 1% р-ра очищенного белка HBsAg
при 280 нм лежит в пределах от 37,3 до 60,0 [13].
Методом электорофореза в ДСН – ПААГ в очищенных препаратах (22 нм) –
частиц HBsAg adw - , ayw – и adr – подтипов выделено 7 или более
полипептидов с молекулярной массой от 25000 до 100000. В связи с тем, что
наружная оболочка вирионов HBV содержит HBsAg и липиды (частично взятые у
клетки хозяина), предположили, что она химически похожа на 22 нм частицу
HBsAg [5,7,15].
1.2.3 Структура вирусных нуклеокапсидов.
Сердцевина вириона несет сердцевинный антиген HBV (HBcAg), который
обнаружен в крови, как внутренний компонент вириона. Он иногда определяется
в сыворотке в ранний период виремии до появления антител к HBсAg.
Исследования показали, что значительная фракция HBсAg – частиц, выделенных
из вирионов и меньшая фракция их выделенная из зараженной печени, имеет
высокую плавучую плотность в CsCl (1,38 г/см3) и содержит ДНК и ДНК -
полимеразную активность [1,13,15]. Установлено, что высокоочищенные
сердцевины, полученные из вирионов и HBсAg – частицы, выделенные из печени,
содержат несколько уникальных полипептидов от 19 к до 38 к. Полипептид 19 к
может реагировать с антителами е – антигену HBV (анти - HBe) [14,15].
1.2.3.1 Природа HBeAg
Идентифицирован в 1972 году; физически и антигенно отличается от HBsAg
и HBсAg, трудно поддается очистке, представляет собой комплекс антигенов. В
огаровом геле дается до 3 линий преципитации: е1, е2, е3. в сыворотках
больных HBV определяются как связывающийся с (IgG) HBсAg с молекулярной
массой 300 к, так и меньший «свободный» HBeAg с молекулярной массой 30 – 35
к. Свободная форма способна к диссоциации на меньшие полипептиды с
молекулярной массой 15,5 к. Особо следует отметить, выраженную корреляцию
присутствия HBeAg в сыворотке больных с высокой концентрацией физических
вирусных частиц. Есть данные, что HBeAg и вирионы продуцируются вместе во
время инфекции, кроме этого известно, что HBeAg является компонентом
вириона, из которой активно высвобождается при разрушении ее детергентом
[5,15].
Информация об HBeAg заложена в С – гене. Многочисленные факты,
полученные при изучении HBV позволили сделать вывод о связи HBeAg с
инфекционностью и наличием вируса. Оказалось, что инфекционность сывороток
крови с HBeAg в миллион раз выше, чем с анти – Hbe. Однако, эта связь не
абсолютна. Выявлены мутантные формы HBV, при которых блокируется синтез
HBeAg. При этом, не смотря на наличие анти – Hbe в сыворотке крови удается
тестировать ДНК – HBV. Исследования последних лет, связанные с изучением
мутантных форм HBV, позволили по-новому взглянуть на значение HBeAg в
патогенезе HBV. Предполагают, что у матерей носителей HBV HBeAg, проходя
через плаценту, вызывает развитие иммунной толерантности, приводящей к
прогрессированию в хронический гепатит [7,15].
1.2.3.2 Роль HBxAg
Считают, что х – антиген является как регуляторным белком, усиливающим
синтез вирусных белков, так и возможно, белком, включенным в структуру HBV.
HBxAg играет особую роль в развитии первичной гепатоклеточной карциномы. Р
– ген, ДНК – полимеразы - фермент, информация о котором заложена в ДНК HBV.
Он обладает ферментативной активностью как РНК – зависимая ДНК – полимераза
и необходим для достройки внутренней короткой цепи ДНК HBV в процессе ее
репликации [13,15].
1.2.4 Физическая и генетическая структура вирусной ДНК.
Вирионы HBV имеют маленькую кольцевую, частично двухцепочечную молекулу
ДНК. Одноцепочечные участки варьируют по длине, составляя в различных
молекулах от ( 15 до 60%. Таким образом, ДНК состоит из длинной цепи L
постоянной длины (( 3220 оснований) во всех молекулах и короткой (S),
которая в различных молекулах варьирует по длине от 1700 до 2800 оснований.
ДНК полимеразы достраивает одноцепочечные участки вирусной ДНК до полностью
двухцепочечной молекулы, содержащей приблизительно 3200 bр. Синтез ДНК
начинается на 3' конце короткой цепи, которая в разных молекулах находится
на различных участках в пределах специфической области ДНК и заканчивается
по достижении 5' конца короткой цепи, расположенного в строго определенной
месте. Длинная цепь не является замкнутой окружностью: в точке,
расположенной приблизительно на расстоянии 300 bp от 5' конца короткой
цепи, существует разрыв. С помощью нагревания при определенных условиях,
которая вызывает избирательную денатурацию 300 – нуклеотидной области между
5' концом короткой цепи и разрывом длинной цепи, кольцевая ДНК может быть
превращена в линейную форму с одноцепочечными липкими концами. Линейная
форма может быть вновь переведена в кольцевую путем реассоциации
комплементарных одноцепочечных концов. По видимому, 5' концы обеих, как
длиной, так и короткой цепей ДНК HBV блокированы таким образом, что
предотвращено их фосфорилирование полинуклеотиназой. Химическая природа
цепи ДНК, выделенной из вирионов ковалентно присоединена к полипептиду, что
предотвращает ее фосфорилирование [7,15].
1.2.5 Механизм репликации вирусов.
После проникновения вируса в клетки печени в клеточных ядрах
формируются замкнутые кольцевые вирусные ДНК, состоящие из 3200 bp. Они
