Содержание аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах здоровых детей и страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом
действию восстановителей, при этом в АК восстанавливается только ДАК. В
качестве восстановителя использовали димеркаптопропансульфонат натрия
(унитиол)
Реактивы:
1. 2.10 М унитиол (0.84 мл 5% раствора ампулированного препарат в 100 мл
0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. хранить не более суток).
2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Хранить в холодильнике не более
двух недель.
3. 85% раствор серной кислоты (100 мл воды + 900 мл концентрированной
серной кислоты).
4. 2% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н серной кислоте, содержащей
0.25% тиомочевины (хранить в холодильнике не более 1 месяца).
5. 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия (краска
Тильманса). Хранить в темноте не более 1 недели.
6. 0.9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).
Ход определения.
В три пробирки помещали по 0.5 мл упакованных и отмытых от плазмы
эритроцитов с известным гематокритом. В первую прибавляли 0.25 мл
физиологического раствора и 0.25 мл унитиола. После пятнадцатиминутной
инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали 0.5 мл
экстракта, к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ.
В две другие пробирки также прибавляли по 1.5 мл ТХУ.
В две пробирки вносили по 0.75 мл супернатанта, полученного при
центрифугировании смеси упакованных эритроцитов с ТХУ. В одну из пробирок
добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия до
появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд. В
третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта, полученного после
центрифугирования смеси упакованных эритроцитов с физиологическим
раствором, унитиолом и ТХУ. Во все пробирки добавляли по 0.25 мл 2,4-
динитрофенилгидразина и доводили объём до 1.25 мл дистиллированной водой,
инкубировали при 100 0 С в течение 10 минут и охлаждали в ледяной бане. В
каждую пробирку добавляли небольшими порциями 1.25 мл 85% раствора серной
кислоты, охлаждая в ледяной бане после каждой порции. Окрашенные растворы
фотометрировали через час при длине волны 540 нм.
Концентрацию кислот определяли по формуле:
С = (3*А)/0.085; где
С – концентрация кислот, мг%
3 – концентрация стандартного раствора, мг%
А – оптическая плотность пробы
0.085 – оптическая плотность стандартного раствора
2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты исследований обрабатывались статистически (Лакин И.А., 1976).
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Целью исследования являлось определение содержания аскорбата и его
окисленных форм – ДАК и ДКГК в общей эритроцитарной массе взрослых,
страдающих ИЗСД, со стажем болезни более 10 лет; сравнение и сопоставление
полученных результатов с данными, полученными ранее, в ходе работы со
здоровыми детьми и страдающими ИЗСД. В эксперименте участвовал 21 взрослый
в возрасте от 25 до 40 лет, 37 больных детей и группа контроля, включающая
10 здоровых детей. Результаты исследований отображены на диаграммах.
Рис.1. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей
и детей, страдающих ИЗСД (мг%)
Рис. 2. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых,
страдающих ИЗСД (мг%)
Как следует из полученных результатов, в эритроцитах детей и взрослых,
страдающих ИЗСД, наблюдается увеличение содержания окисленной форма АК-ДАК,
что может свидетельствовать о нарушении процесса восстановления АК в ДАК,
большем участии АК в метаболических процессах, нарушении транспорта АК в
клетке.
Процентное содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК также демонстрирует
превалирование окисленных форм АК над восстановленной.
Рис. 3. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей
и страдающих ИЗСД (%).
Рис. 4. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых,
страдающих ИЗСД (%).
Все полученные данные согласуются с данными литературы об изменении
общего количества АК в организме при патологии (нормальное содержание
составляет 5 – 15 мг%) и соотношения «окисленная форма АК/восстановленная
форма АК» в сторону увеличения первой.
ВЫВОДЫ
1. Содержание общей АК в эритроцитах детей и взрослых, страдающих ИЗСД,
составляет 19.52 мг% и 6,47 мг%, в эритроцитах здоровых детей –
12.48 мг%.
2. Содержание восстановленной АК в эритроцитах больных детей и взрослых
составляет 4.1 и 2,01 мг% (20.5 и 31% от общей АК), в эритроцитах
здоровых детей – 4.28 мг% (33%).
3. Содержание окисленных форм АК – ДАК и ДКГК в эритроцитах больных
детей и взрослых составляет 15.5 и 4.46 мг% (79.5 и 69% от общей
АК), в эритроцитах здоровых детей – 8.36 мг% (67%).
4. В общей эритроцитарной массе больных детей соотношение окисленная
форма АК/ восстановленная форма АК составляет 4/1, что
свидетельствует о превалировании окисленной формы АК над
восстановленной.
5. В общей эритроцитарной массе здоровых детей это соотношение равно
2/1, т.е., налицо тенденция к росту содержания восстановленной АК.
Заключение
Уже давно доказали тот факт, что аскорбиновая кислота является
постоянной составной частью тканей и органов человека. Важность выполняемых
ею физиологических функций не подлежит сомнению. Некоторые из них давно
известны и хорошо изучены. Например, то, что витамин С оказывает
благоприятное воздействие на работу иммунной системы, нормализует
эритропоэз и продукцию коллагена, является компонентом антиоксидантной
системы клетки. Однако многочисленные исследования недавнего времени
показали, что возможности этого вещества гораздо шире, чем представлялось
до сих пор. К примеру, было обнаружено ценное свойство аскорбата
нормализовать уровень сахара в крови, оказывая положительное воздействие на
углеводный обмен. При выполнении этой и других биохимических функций
аскорбиновая кислота обратимо окисляется в ДАК, при последующем воздействии
окислителя необратимо переходит в ДКГК. По данным литературы, соотношение
«окисленная форма АК/восстановленная форма АК» может изменяться при
различных патологиях, как и ее общее содержание в организме. Одной из
распространенных патологий является инсулинзависимый сахарный диабет.
Поскольку ИЗСД является эндокринной патологией, протекающей с нарушением
углеводного обмена, в регуляции которого аскорбат играет немаловажную роль,
было бы логичным предположить, что его содержание в организме больного
окажется иным, чем у здорового человека. Экспериментальные данные
подтвердили это предположение. В организме больного ребенка содержание
общей АК повышено на 37 % по сравнению с общей АК и составляет 19,52 мг%,
тогда как нормальным считается наличие от 5 до 15 мг% аскорбата. Среднее
значение АК у здорового ребенка – 12,48 мг%. В то время как содержание ДКГК
в процентном соотношении практически не изменено и составляет у больных и
здоровых детей 46 и 49,4 % соответственно (6,16 мг% и 8,96 мг%),
концентрация ДАК у больных детей повышена против здоровых почти вдвое и
составляет 33,5 % вместо 17,6 % (6,54 мг% и 2,2 мг%). Основные различия
выявляются в процентном содержании восстановленной формы АК. Ее содержание
у здоровых детей составляет 33 % общей АК (4,28 мг%), тогда как у больных
детей оно ниже на 13 % и составляет 4,1 мг%. Таким образом, соотношение
«окисленная форма АК/восстановленная форма АК» у больных детей составляет
4:1, в отличие от здоровых детей, у которых оно равняется 2:1.
На основании этих данных можно предположить следующие причины подобных
изменений содержания общей АК и ее метаболических форм в организме больных
ИЗСД детей:
1) При ИЗСД нарушены все виды обмена веществ в организме – углеводный,
белковый и жировой. В последнем случае возрастает количество
свободных радикалов, вследствие чего АОС испытывает большую нагрузку.
Возрастает содержание одного из ее компонентов – аскорбата, он более
активно включается в метаболические процессы, возможно, тем самым в
какой-то мере компенсируется снижение концентрации другого ее
компонента – С-SH;
2) Почти двукратное возрастание уровня ДАК в организме больного ребенка
при практически неизменном количестве ДКГК может свидетельствовать о
нарушении процесса восстановления ДАК в АК; возможно снижена
активность фермента ДАК – редуктазы. При ИЗСД ее активность снижена
на 50 %, что приводит к сокращению содержанияС-SH, необходимого для
процесса восстановления ДАК в АК. Одновременно снижается активность
