Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)
форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее
время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера
и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.
Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью
векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40,
некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее.
Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление
"лишних" сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не
существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV
(вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень
экспрессии генов.
Удобными оказались так называемые "челночные векторы", способные
реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их
получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и
бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за
репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные
операции по конструированию вектора в бактериальной клетке (что технически
намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для
клонирования генов в животной клетке.
[pic]
Рисунок 5. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.
1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО
ГЕНА, СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА
Полученные рекомбинантные молекулы переносятся в определенные группы
клеток, которые должны обеспечить экспрессию этих генов, то есть синтез
соответствующих белков в количествах, экономически рентабельных по
сравнению с обычной технологией их производства.
Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры
клеток, а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток.
Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом
отношении является грамотрицательная бактерия Escherichia coli, поэтому для
нее можно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные
конструкции. Однако E. coli слабо освоена промышленностью. Кроме того, она
относится к условно-патогенным для человека микроорганизмам, что может
создать трудности при получении на ее основе фармацевтических препаратов.
Отмеченные недостатки E. coli легко преодолеваются при конструировании
методами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клеток Bacillus
subtilis. Данная почвенная бактерия безопасна для человека и животных и
прекрасно освоена микробиологической промышленностью. Бактерия B. subtilis
по степени изученности следует за E. coli. Важное отличие ее от E. coli -
способность эффективно секретировать во внешнюю среду целый ряд белков,
поэтому особенно интересны работы по созданию штаммов-продуцентов B.
subtilis, секретирующих чужеродные белки из клеток. Однако данная бактерия
имеет свои недостатки: рекомбинантные плазмиды в B. subtilis
характеризуются нестабильностью, выражающейся в перестройках и делециях
ДНК; бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз,
что существенно усложняет вопрос максимализации генноинженерного получения
целевого белка на основе бацилл-продуцентов.
Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является
низший эукариот Saccharomyces cerevisiae. Одно из преимуществ S. cerevisiae
как экспериментальной системы - простота и надежность ее генетического
анализа. В клетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования
белков, которая обеспечивает возможность синтеза в них полноценных белков
высших эукариот. Аналогичных систем процессинга белков в бактериальных
клетках нет. Многие штаммы дрожжей освоены микробиологической
промышленностью. Доказана их безвредность для человека и животных. Именно
на S. cerevisiae создан первый штамм-продуцент поверхностного антигена
вируса гепатита Б, позволивший получить и испытать вакцину против данного
вирусного заболевания человека.
С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла
система культивируемых клеток животных. Особый интерес к культурам клеток
животных стал проявляться после обнаружения того, что часть эукариотических
генов раздроблена и лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь
правильной экспрессии таких генов. Кроме того, многие белки животных и их
вирусов синтезируются первоначально в виде более высокомолекулярных
предшественников, которые в результате специфического протеолитического
процессинга переходят в так называемую зрелую форму. Такой процессинг
данных белков, по-видимому, можно ожидать лишь в системе клеток животных.
Все это убедительно доказывает важность разработки экспрессирующей системы
на основе клеток животных.
Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в
векторные молекулы встраивают определенные фрагменты ДНК, позволяющие
увеличить выход чужеродного белка. Так, для достижения более высокого
уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E. coli были использованы различные
по силе промоторы (промоторы генов cat, kan, bla, trp и тандемно
расположенных промоторов генов kan и trp). Уровни синтеза
последовательностей HВsAg (нативного и в составе химерных белков)
составляли в зависимости от используемых конструкций векторов от 100 до
100000 молекул на клетку.
1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ
УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В
КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА
Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема
целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК
от действия нуклеаз крови. В результате экспериментальной работы были
созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в
клетки-мишени.
Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора
для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качестве
модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некроза
опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная
плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются
антитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и
антителами применяется для связи компонентов (положительно заряженный
спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный
молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-
мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать
доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный
комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в
клетки.
В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки
костного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий
фактор человека (чГ-КСФ). Данный белок относится к семейству
гемопоэтических факторов роста и является одним из физиологических
регуляторов, специфически и высокоэффективно стимулирующих пролиферацию и
дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов. чГ-КСФ
увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга, усиливает
функциональную активность зрелых нейтрофилов. Созданный вектор представляет
собой многослойную конструкцию. "Центральным ядром" конструкции является
плазмида pGGF8, содержащая ген чГ-КСФ. Ее окружает полисахаридная оболочка,
которая состоит из полиглюкина и спермидина. Внешний белковый слой содержит
смесь сывороточного альбумина и белка доставки - трансферина.
Эффективность описанной векторной модели была доказана опытным путем.
Итак, при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин
немаловажное значение имеет создание специального вектора-носителя,
обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз
крови.
2. ВАКЦИНА ПРОТИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК,
ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Возбудителем лейкемии кошек является ретровирус типа С. Вирус лейкемии
кошек (FeLV) имеет в качестве генетического материала молекулу РНК.
Заболеваемость и смертность среди домашних кошек в Швейцарии довольно
высока. Вакцина против FeLV, изготовленная традиционным путем, была
разработана несколько лет тому назад и находится в продаже в Швейцарии.
Высокая цена современных вакцин и отсутствие уверенности в отношении
длительности эффекта и надежности вакцины вызвали необходимость создания
вакцины с помощью генной инженерии.
При конструировании рекомбинантной вакцины оболочечный протеин вируса
(env-ген) клонировался в пивных дрожжах (Saccharomyces cerevisiae). Env-ген
вначале лигировался с промотором дрожжей (пируваткиназный промотор), а
затем клонировался в так называемом "Shuttle"-векторе. Вектор "Shuttle"
(челночный вектор) может размножаться как в бактерии E. coli, так и в
пивных дрожжах S. cerevisiae.Он содержит с одной стороны репликационные
оригины как для дрожжей, так и для E. coli, а с другой стороны селекционный
маркер для дрожжей (leu2 ген) и для E.coli (резистентность к ампицилину).
Из литра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env-протеина и
затем тестируют в опыте по вакцинации. Результат вселяет надежду: 10 кошек
были иммунизированы env-протеином, причем 4 дали ответ антителами. Через 2
недели провели заражение FeLV. Теперь все животные давали ответ антителами.
Таким образом, полученная вакцина оказалась эффективным средством для
борьбы с данным заболеванием.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Грен Э. Я., Пумпен П. П. Рекомбинантные вирусные капсиды - новое
поколение иммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО. - 1988. - т.
II, №5. - с. 531-536.
2. Дмитриев Б. А. Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин
// Иммунология. - 1986. - №1. - с. 24-29.
3. Лебедев Л. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И.,
Рязанкин И. А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-
мишени // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 3-12.
4. Мертвецов Н. П., Беклемишев А. Б., Савич И. М. Современные подходы
к конструированию молекулярных вакцин. - Новосибирск: Наука, 1987,
210 с.
5. Сизов А. А., Лебедев Л. Р., Масычева В. И., Кашперова Т. А., Одегов
А. М. Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-
опосредованного транспорта гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in
vivo // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 13-18.
6. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы
генетической инженерии. - М.: Изд-во МГУ, 1994, 224 с.
7. Щелкунов С. Н. Клонирование генов. - Новосибирск: Наука, 1986, 232
с.
8. Юров Г. К., Народицкий Б. С., Юров К. П. Конструирование и
использование ДНК-вакцин // Ветеринария. - 1998. - №12. - с. 25-27.
9. Hubscher U. Генная инженерия и ветеринария. Вакцины, изготовленные
с помощью генной инженерии, и анализ высоковариабельных участков
ДНК. -Schweiz. Arch. Tierheilk., 1987, 129, №11, 553-564.
