Клонирование
ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской
породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров
одного 32-клеточного зародыша (рис. 3). Автор утверждал, что большинство
ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их
часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие
реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы.
После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает
автор, они могут и дальше нормально развиваться.
Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные
зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку
синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из
них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в
результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.
Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота
достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное
развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические
трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически
решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие
тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.
Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа.
Скудность данных, видимо, и связана с определенными трудностями работы с
этим объектом.
Клонирование овец
Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-
клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность.
Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных
зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном
яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и
пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае
донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых
ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров.
В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного
эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки
овец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых
соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью
сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также
соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки
эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития
генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут
репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное
развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в
качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или
культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают
тотипотентностью.
Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством
Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых
была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим
образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного
овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение
многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура
напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но
вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и
морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного
зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных
стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4
на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в
энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II).
Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в
перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода
первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые
достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы -
окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось
5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10
дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного
возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой
получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, -
значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала
столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами,
опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате
использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено
клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во
многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые
использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки
(фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы
взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы
финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа
клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец.
Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах
культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и
клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов
останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные
ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных
эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые
и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или
бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое
выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки
необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием
in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные
данные.)
Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной
железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в
качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или
эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в
матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза
ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных
яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень
низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ
генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов
живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для
одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех
ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки,
донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы
финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно
отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров
подтвердил этот результат.
Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием
длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре
клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки,
которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение
также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих
работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и
клеток доноров.
Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов
обойти этические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток
реципиента или использовать животных. Но это только "косметический"
метод. Реальный шаг к бессмертию - искусственное изменение ДНК. В июне 2000
года и случилось то, чего так долго ждали и чего некоторые так боялись.
Появилось сообщение, что ученым из уже знаменитой своей овцой Долли
шотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин
Института в Эдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек с измененной
ДНК. Шотландские ученые смогли осуществить клонирование, при котором
генетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону. Однако
