Клонирование
Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до
стадии бластоцисты.
В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что
они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только
материнский, а две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от того, какой
пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял
развитие особи по типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но
описанию авторов, с тем, что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число
хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали
полученные диплоидные гомозиготные (с двумя одинаковыми наборами генов)
зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-
реципиента для дальнейшего развития.
Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной
гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для
получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого
скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются
десятки лет работы.
Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось,
хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом
диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на
тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из
неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.
Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в
клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что
высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер
использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то
реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии
бластоцисты.
Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными
экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц,
активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы
мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же
наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в
партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши
развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если
добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом
яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского
ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации
мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей
обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух
женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.
Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих
требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у
одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому
работы Хоппе и Илменси не удалось повторить.
Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В
1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в
энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток
нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете
вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.
Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических
зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе
материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти
функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде
работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих
требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще
больший резонанс.
Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы
бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей
(двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей.
Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один
прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до
стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных
бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982)
эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще
более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей.
Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных
результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена
под сомнение.
МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток
внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro
реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует
стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает
возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19%
реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей,
смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.
Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей
клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень
ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других
млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,
активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-
клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в
клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не
на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу,
значительно расширили наши представления о методологии клонирования
млекопитающих.
Кролики, коровы и свиньи
Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и
Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов
одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип
родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.
Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в
нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не
позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически
идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она
показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных,
коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in
vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)
реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку
окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где
их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать
реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем
трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов
реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в
культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие
результаты и при культивировании.
Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения
ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и
Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и
женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4-
или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы
освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были
хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При
помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из
бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в
энуклеированную зиготу.
Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и
пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их
вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные
зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы
пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или
бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку
коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве
доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то
реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.
Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что
