RSS    

   Клонирование

Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до

стадии бластоцисты.

В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что

они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только

материнский, а две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от того, какой

пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял

развитие особи по типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но

описанию авторов, с тем, что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число

хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали

полученные диплоидные гомозиготные (с двумя одинаковыми наборами генов)

зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-

реципиента для дальнейшего развития.

Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной

гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для

получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого

скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются

десятки лет работы.

Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось,

хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом

диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на

тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из

неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.

Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в

клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что

высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер

использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то

реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии

бластоцисты.

Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными

экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц,

активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы

мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же

наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в

партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши

развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если

добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом

яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского

ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации

мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей

обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух

женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих

требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у

одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому

работы Хоппе и Илменси не удалось повторить.

Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В

1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в

энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток

нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете

вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических

зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе

материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти

функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде

работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих

требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще

больший резонанс.

Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы

бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей

(двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей.

Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один

прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до

стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных

бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982)

эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще

более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей.

Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных

результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена

под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток

внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro

реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует

стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает

возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19%

реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей,

смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей

клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень

ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других

млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,

активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-

клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в

клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не

на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу,

значительно расширили наши представления о методологии клонирования

млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и

Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов

одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип

родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в

нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не

позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически

идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она

показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных,

коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in

vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)

реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку

окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где

их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать

реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем

трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов

реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в

культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие

результаты и при культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения

ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и

Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и

женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4-

или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы

освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были

хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При

помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из

бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в

энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и

пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их

вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные

зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы

пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или

бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку

коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве

доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то

реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5


Новости


Быстрый поиск

Группа вКонтакте: новости

Пока нет

Новости в Twitter и Facebook

                   

Новости

© 2010.