Клонирование (Долли - случайность или закономерность?)
зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку
синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка [20]. Семь
из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в
результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.
Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота
достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное
развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические
трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически
решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие
тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.
Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа [21].
Скудность данных, видимо.и связана с определенными трудностями работы с
этим объектом.
Клонирование овец
Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной
стадии развития ядра сохраняют тотипотентность [22]. Реконструированные
яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались
нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом
цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго
реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных
зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соотнетстиовал
породе овец - доноров.
В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного
эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки
овец [23]. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых
соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью
сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также
соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки
эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития
генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут
репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное
развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в
качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или
культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают
тотипотентностью.
Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством
Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых
была культура эмбриональных клеток [24]. Клеточную культуру получали
следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-
дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в
течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура
напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но
вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и
морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного
зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных
стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4
на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в
энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II).
Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в
перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода
первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые
достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы -
окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось
5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10
дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного
возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой
получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, -
значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала
столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами,
опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате
использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено
клональное животное - овца по кличке Долли [25]. Последняя работа
методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней
ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные
клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной
железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы
породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все
три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно
у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м
пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м
пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех
трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в
энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство
реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе
овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент
выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии
опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому,
видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно
обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом
нужны дополнительные данные.)
Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной
железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в
качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или
эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в
матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза
ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных
яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень
низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ
генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов
живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для
одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех
ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки,
донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы
финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно
отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров
подтвердил этот результат.
Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных
клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли
быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и
были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт,
что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали
стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.
Заключение
Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в
начале 50-х годов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех
десятилетий. Что касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем
разделе, несмотря на значительные достижения, проблема клонирования
взрослых особей остается до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе
клеточной дифференцировки у позвоночных происходит или потеря определенных
генных локусов или их необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается
та часть генома, которая контролирует не ранние, а более поздние этапы
онтогенеза, в частности, метаморфоз амфибий. Механизм этого явления пока не
поддается научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослых
позвоночных необходимо использовать малодифференцированные делящиеся
клетки. Это методически важное положение было учтено в более поздних
работах.
В 1979 году американский биолог МакКиннел, внесший большой вклад в
работу с амфибиями, утверждал, что полученные результаты не позволяют
серьерно говорить о возможности клонирования человека [26] - тогда это
казалось недоступным для экспериментальных эмбриологов. Однако еще в то
время многие ученые, писатели и даже политики стали активно обсуждать
возможностт клонирования человека, а некоторые исследователи даже
