Клонирование
погибают, а тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические
(развивающиеся из неоплодотворённой яйцеклетки) эмбрионы.
Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в
клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и
сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в
качестве доноров ядер они использовали зиготы, но если донорами
были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и
прежде, развивались только до стадии бластулы.
Метод МакГрата - Солтера стал широко использоваться разными
экспериментаторами. Так Манн и Ловел-Банж выделяли пронуклеусы яиц,
активированных к партеногенезу, и пересаживал их в энуклеированные
зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях.
Если же, наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворённых яиц и
пересаживали в партеногенетические и лишённые ядра яйца, то такие
зародыши развивались нормально до рождения.
Сурани с соавторами установили, что если добавить женские пронуклеус
из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то
нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра
приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинация
женского и мужского пронуклеусов из ранних оплодотворённых
яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация 2-х
мужских или 2-х женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.
Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих
требуется два набора хромосом – отцовский и материнский. Поэтому ни
у одного из известного вида млекопитающих не описан партеногенез.
Поэтому же работы Хоппе и Илменсе не удалось повторить.
Однако такие исследование ещё дважды будоражили научное сообщество.
В 1982 году пересадили ядра клеток партеногенетических бластул
мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных
яйцеклеток нормально развивались, и якобы получены четыре взрослых
самки, но в свете вышесказанного эти результаты маловероятны.
Гибель партеногенетических (гиногенетических и андрогенетических)
зародышей у млекопитающих связана с различной активацией онтогенеза
материнского и отцовских геномов. Механизм, регулирующий эти
функциональные различия, был назван геномным импритингом и изучался
в ряде работ, где было показано, что для нормального развития
млекопитающих требуется наличие мужского генома.
Другая статья Илменсе и Хоппе имела ещё больший резонанс. Авторы
сообщили о пересадки ядер внутренней клеточной массы бластулы в
энуклеированные зиготы мышей и получения трёх взрослых особей (двух
самок и одного самца), генетически идентичной донорской линии
мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы
проводили за один приём, затем реконструированные яйцеклетки
культивировали in vitro до стадии бластулы и пересаживали в матку
самок. Из 16 пересаженных бластул три развились во взрослые особи.
В следующей работе эти же авторы использовали в качестве доноров-
ядер клетки эмбрионов ещё более поздней стадии (семь суток) и
будто бы получили трёх половозрелых мышей. Однако никто из
работающих в том же направлении не смог добиться подобных
результатов, и достоверность результатов Илменсе и Хоппе вновь была
поставлена под сомнение.
МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток
внутренней клеточной массы бластулы не обеспечивают развития in
vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая
предшествует стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточных
зародышей даёт возможность развиваться только до стадии морулы. В
тоже время 19% реконструированных яйцеклеток 2-ядерных клеточных
зародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.
Эти и другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей
клеточное ядро рано теряет тотипотентность, что связано, очевидно, с
очень ранней активизацией генома зародыша – уже на стадиях двух
клеток. У других млекопитающих, в частности у кроликов, овец и
крупного рогатого скота, активизация первой группы генов в
эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16 клеточной стадии. Возможно,
поэтому первые значительные успехи в клонировании животных были
достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.
Тем не менее, особый интерес вызывают опыты группы учёных из
университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось
усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь пойдёт ниже, они
отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической
клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью
которой можно было бы безболезненно извлекать ядро из соматической
клетки и трансплантировать его в обезъядренную клетку. Кроме того,
авторы использовали в качестве донорских относительно менее
дифференцированные ядра клеток, окружающих ооцит. Наконец, удалось,
как бы синхронизировать процессы, протекающие в яйцеклетке и
трансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить естественные
ядерно-цитолазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой,
поскольку трансплантируемое дифференцированное в определённом
направлении ядро и цитоплазма яйцеклетки до того работали как бы
в разных режимах.
Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит
(клеток так называемого cumulus oophorus), клеток Сертоли из
семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из
соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью
микропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальный
раствор (так называемый HEPES-CZB), свободный от кальция, и добавляя
стронций и цитохалазин.Стронций активировал яйцо, а кальций подавлял
образование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8
клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в матку
приёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из
них (15-16%) продолжали своё развитие. Процент выхода рождённых
мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 5-19-й дни
беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2
до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер
рождённых мышат к клеткам донора соматических клеток.Таким образом,
по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер
соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.
Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу,
значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих.
Кролики и коровы.
Американские исследователи Стик и Робл, используя метод Солтера и
МакГрата, получили шесть живых кроликов, пересадив ядра 8-клеточных
эмбрионов одной породы в лишённые ядра яйцеклетки кроликов другой
породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.
Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%)
развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход,
практически не позволяющий рассчитывать на получение таким способом
клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не
менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов
кроликов.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных,
коров или овец, идёт несколько по-другому. Их сначала культивируют
не in vitro, а in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы –
промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и
трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы
или овцы соответственно, где их развитие происходит до развитого
детёныша. Уиландсин предложил заключить реконструированные яйцеклетки
в агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный
яйцевод овцы или коровы. По данным одних авторов реконструированные
зародыши лучше развиваются в яйцеводе, чем в культивированной среде,
хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при
культивировании in vitro.
Американцы Робл и его сотрудники использовали щадящий метод
извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенные
МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые
кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их
цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы.
Сначала пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусы
от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны
