Клонирование
партеногенезу в их генотипе образуется комплекс генов
жизнеспособности, компенсирующей вредное влияние искусственного
размножения. При переводе клонов на половое размножение этот
комплекс, оказавшись несбалансированным, сильно повышает гетерозис.
Первые опыты на амфибиях
Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была
показана в конце 40-х начале 50-х гг. в опытах на амфибиях, когда
российский эмбриолог Георгий Викторович Лопашов разработал метод
пересадки (трансплантации) ядер в яйцеклетку лягушки. В июне 1948
года он отправил в «Журнал общей биологии» статью, написанную по
материалам собственных экспериментов. Однако на беду Лопашова в
августе 1948 года состоялась печально известная сессия ВАСХНИЛ,
утвердившая по воле коммунистических вождей беспредельное господство
в биологии малограмотного агронома Т.Д. Лысенко, и набор статьи
Лопашова, принятой к печати, был рассыпан, потому что она доказывала
ведущую роль ядра и содержащихся в нём хромосом в индивидуальном
развитии организмов. Работу Лопашова забыли, а в 50-х гг.
американские эмбриологи Бриггс и Кинг выполнили сходные опыты, и
приоритет достался им, как это часто случалось в истории российской
науки.
Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер
эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишённые
ядра клетки (энуклеированные клетки).
Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней
стадии его развития – бластуле (бластула – стадия в развитии зародыша,
представляющая собой полный шар из одного слоя клеток), то примерно
в 80% случаях зародыши благополучно развиваются дальше и
превращаются в нормального головастика. Если же развитие зародышей
продвинулось на следующую стадию – гастулу, то лишь менее чем в 20%
случаев оперированные клетки развивались нормально. Эти результаты
позже были подтверждены в других работах.
Большой вклад в эту область внёс английский биолог Гёрдон. Он
первый в опытах с южноафриканской жабой Xenopus laevis в
качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже
вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего
головастика. Ядра яйцеклеток-реципиентов он не удалял хирургическим
путём, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев
реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая
часть из них образовывала эмбрионы, 5% из этих эмбрионов достигалы
стадии бластулы, 2,5% стадии головастика и только 1% развивалось в
половозрелые особи (схема) однако появление нескольких взрослых
особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток
эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительно
присутствуют первичные половые клетки, ядра, которых могли быть
использованы для пересадки. В последующих работах, как самого автора,
так и других исследователей не смогли подтвердить данные этих
первых опытов.
Позже Гёрдон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство
реконструированных яйцеклеток с ядром клетки кишечного эпителия
погибают до завершения стадии гастулы, он попробовал извлечь из них
ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые
энуклеированные яйцеклетки, такая процедура называется «серийной
пересадкой». Число зародышей с нормальным развитием после этого
увеличилось, и они развивались до более поздних стадий по
сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки
ядер.
Затем Гёрдон вместе с Ласки (1970 г од) стали культивировать in
vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, лёгкого и
кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве
доноров ядер. Примерно 25% первично реконструированных яйцеклеток
развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они
развивались до стадии головастика. Таким образом, было показано, что
клетки 3-х разных тканей взрослого позвоночного содержит ядра,
которые могут обеспечить развитие по крайней может до стадии
головастика.
В свою очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации
ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови –
эритроцитов лягушки Rana Pipiens. После серийной пересадки таких
ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего
головастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок
(более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше
стадии головастика не развивались.
Таким образом, во многих работах показано, что в случаи амфибий
донорами ядер могут стать лишь зародыши на ранних стадиях
развития.. Некоторые авторы называют подобные эксперименты
клонированием амфибий, хотя правильнее их называть клонированием
эмбрионов амфибий, так как в этом случае размножают бесполым путём
не взрослых животных, а их зародышей.
Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается
инактиваций неработающих генов, поэтому клетки теряют тотипотентность,
дифференцировка становится необратимой. В конце концов, у одних
клеток происходит репрессирование генома, у других в той или иной
степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже
ядро. Однако на ряду с дифференцируемыми клетками, культивируемыми in
vitro клеточные популяции содержат малодифференцируемые стволовые
клетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для
клонирования млекопитающих.
Опыты с амфибиями показали, что ядра различных клеток одного и
того же организма генетически идентичны и в процессе дифференцирвки
постепенно теряют способность обеспечивать развитие
реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и
культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивают эту
способность.
Неудачи экспериментов с мышами.
Успешные опыты с амфибиями заставили задуматься учёных о
клонировании млекопитающих, в частности мышей.
МакКиннелл в одной из своих работах отмечал, что необходимые для
этого методы уже существуют и непонятно почему мышь до сих пор
не клонирована.
Однако предсказания МакКиннелла не сбылись, хотя в конце 70-х гг.
опыты на мышах действительно начались и протекали весьма
драматично. К тому времени весьма основательно были изучены биология
и генетика ранних этапов развития млекопитающих и в частности
мыши как модельного объекта.
Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего, потому
что объём яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше,
чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены.
Экспериментаторы научились успешно микрохирургическим путём удалять
пронуклеусы (одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих, в
период после проникновения сперматозоида, но до слияния женского и
мужского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения.
Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское
из хромосом яйцеклетки) из зигот мыши и пересаживать в них
клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разным
способом зародыши мышей развивались лишь до стадии бластулы.
В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменсе о
том, что они получили 7 взрослых самок мышей, пять из которых
имели только материнский, а две отцовский геном. Это, якобы, зависело
от того, какой пронуклеус был оставлен в яйце – женский или
мужской, он и определял особи по типу гиногенеза или андрогенеза
(гиногенез – развитие яйца без участия сперматозоида, андрогенез –
развитие яйца, имеющие только отцовские хромосомы – мужской
партеногенез). Их успех был связан, по описанию авторов, с тем, что,
удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого,
обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные
диплоидные гомозиготные зародыши in vitro до стадии бластулы и
пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.
Казалось, теперь можно будет быстро получить млекопитающих со 100%
гомозиготностью по всем признакам. Это особенно важно для селекции,
так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности
крупного рогатого скота с закреплёнными особо ценными качествами
обычными приёмами требуются десятки лет работы.
Однако данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие
пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом
диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей
