Клонирование
напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но
вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и
морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного
зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных
стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4
на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в
энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II).
Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в
перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода
первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые
достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы -
окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось
5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10
дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного
возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой
получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное
достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь
шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в
начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского
ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца
по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет
предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только
эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки
соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки
молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет,
находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных
культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец.
Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах
культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и
клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов
останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные
ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных
эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые
и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или
бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое
выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки
необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием
in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные
данные.)
Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной
железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в
качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или
эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в
матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза
ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных
яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень
низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ
генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов
живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для
одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех
ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки,
донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы
финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно
отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров
подтвердил этот результат.
Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных
клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли
быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и
были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт,
что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали
стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.
Комментарий 2003-го года: В 2002 году у Долли было отмечено развитие
артрита, который как предполагается, мог стать результатом генных мутаций,
инициированных процессом клонирования. Помимо артрита у животного
наблюдался целый ряд отклонений от нормального развития и в феврале ученые
усыпили знаменитую овечку из-за прогрессирующей болезни легких. Долли
умерла в возрасте 6 лет. Ученые намерены детально проанализировать
состояние организма животного по результатам вскрытия
Заключение
Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начале
50-х годов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех десятилетий. Что
касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотря
на значительные достижения, проблема клонирования взрослых особей остается
до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки у
позвоночных происходит или потеря определенных генных локусов или их
необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома,
которая контролирует не ранние, а более поздние этапы онтогенеза, в
частности, метаморфоз амфибий. Механизм этого явления пока не поддается
научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослых позвоночных
необходимо использовать малодифференцированные делящиеся клетки. Это
методически важное положение было учтено в более поздних работах.
В 1979 году американский биолог МакКиннел, внесший большой вклад в работу с
амфибиями, утверждал, что полученные результаты не позволяют серьерно
говорить о возможности клонирования человека - тогда это казалось
недоступным для экспериментальных эмбриологов. Однако еще в то время многие
ученые, писатели и даже политики стали активно обсуждать возможностт
клонирования человека, а некоторые исследователи даже приступили к таким
экспериментам. Например, Шеттлз сообщил, что пересадил ядро
сперматогониальной клетки (диплоидного предшественника зрелого гаплоидного
спермия) в лишенную ядра яйцеклетку человека. В результате три
реконструированные яйцеклетки начали дробление, и возникли похожие на
морулы скопления клеток, которые позднее деградировали. Шеттлз полагал, что
если трансплантировать такие группы клеток в матку женщины, то они могли бы
нормально развиваться. МакКиннел тогда справедливо возразил, что такое
предположение маловероятно и совершенно необоснованно.
Еще 5-6 лет назад никто из ученых, а их работало довольно много в этой
области, не ставил вопрос об использовании в качестве доноров ядер клеток
взрослых млекопитающих. Работы сводились, в основном, к клонированию
эмбрионов домашних животных, и многие из этих исследований были не очень
успешны. Поэтому так поразило появившееся в начале 1997 года неожиданное
для всех сообщение авторского коллектива под руководством Уилмута, что им
удалось, используя соматические клетки взрослых животных, получить
клональное животное - овцу по кличке Долли. На самом деле, однако,
исследователи прошли долгий путь, и Уилмуту с сотрудниками пришлось собрать
воедино все существовавшие к тому времени достижения, прежде чем они смогли
сообщить о сенсационном результате своей работы.
У этого первого успешного эксперимента есть существенный недостаток - очень
низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%), и если учесть также высокий
процент гибели развивающихся реконструированных яйцеклеток в плодный период
развития (62%), который в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%), то
встает вопрос о причинах гибели зародышей. Все ли пересаженные донорские
ядра обладали тотипотентностью? Сохранялся ли полностью их функциональный
геном (набор генов, необходимых для развития), все ли нужные для развития
гены были дерепрессированы? Это очень важные вопросы, и по одному животному
нельзя сделать окончательные выводы. Тем более, что результаты исследований
на амфибиях говорят о необратимом характере инактивации, репрессии генов в
ходе клеточной дифференцировки. Возможно, авторам крупно повезло, и они
достаточно случайно в трех разных клеточных популяциях отобрали за короткий
срок стволовые клетки, для которых характерна низкая дифференцированность и
способность к делению. Чтобы подтвердить результат этой, в буквальном
