Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
автоматизированных диагностических систем сканирующего и проточного
типов способствовало быстрейшему внедрению цитометрического метода
исследования в клиническую практику. В процессе развития и освоения
метода происходит его специализация по трем ведущим направлениям.
Первое – это массовые профилактические осмотры населения с целью
выявления ранних стадий заболевания, второе – дифференциальная
диагностика пограничных состояний и злокачественного роста, третье
– контроль динамики опухолевого заболевания в ходе проведения
лекарственной, лучевой и комбинированной терапии, а также
хирургического метода лечения. Особенно плодотворно ведутся
цитометрические исследования в области гематологии, гинекологии,
урологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, метод также
используется для диагностики патологических процессов молочной и
щитовидной желез.
Из истории количественной цитометрии известно, что одним из
первых объектов изучения были форменные элементы крови и
эпителиальные клетки слизистой оболочки шейки матки. Данное
обстоятельство связано с доступностью получения диагностического
материала, разнообразием клеточных элементов, характеризующих
нормальное физиологическое состояние исследуемых объектов, а также
с трудностью морфологической идентификации их при различных
патологических процессах, особенно онкологических заболеваниях.
Гинекология
Достаточно большой опыт применения количественной цитометрии в
области гинекологии позволяет выделить несколько этапов в развитии
количественного метода оценки морфологических особенностей
эпителиальных клеток шейки матки. Первый этап характеризуется
исследованиями, в которых рассматривается возможность осуществления
цитоскрининга, т.е. разграничение патологических процессов на две
группы «норма – рак». Второй этап связан с дифференциацией
пограничных состояний шейки матки по анализу одного, двух критериев
диагностики с последующим применением корреляционного анализа,
построением двух- и трехпараметрических диаграмм зависимостей
изучаемых признаков. Третий этап исследований направлен на
углубленную идентификацию клеток с изучением их структурных
особенностей (интегральная оптическая плотность, содержание ДНК),
отражающих определенные состояния шейки матки при диспластических,
метапластических процессах, внутриэпителиальном и инвазивных
формах рака. Полученные результаты могут послужить основой изучения
механизмов перестройки эпителиального пласта в процессе его
озлокачествления и определения природы злокачественной
трансформации клетки. Характеризуя данное направление, можно
подчеркнуть значимость цитометрических исследований и в области
осуществления контроля качества цитологической и гистологической
диагностики заболеваний шейки матки, а также оценки степени
репарации ткани в процессе лечения. Исходя из фундаментальных
исследований, посвященных оценке более чем 196 качественных и
количественных признаков ядра и клетки и общего фона препарата,
определяют, что более значимы параметры, характеризующие
морфологические особенности ядра (Б.М.Брамберга, И.Я.Зитаре,
Д.П.Плегере, Э.Х.Смилтниекс,1970). Поэтому при количественном
анализе препаратов обычно исходят из информативности размерных и
структурных характеристик ядра: изучают его площадь, периметр,
объем, диаметр, определяют коэффициент формы и оптическую
плотность, содержание ДНК, РНК и белка в нем. На основании данных
проточной цитометрии установлено, что среди обследуемых пациентов с
различной патологией шейки матки в 74,5% случаев имеются
кондиломатозные изменения. Установлен профиль типичной ДНК-
гистограммы для данной патологии шейки матки с высоким содержанием
ДНК в G0/G1-фазе и ранней S-фазе клеточного цикла. Полагают, что
наблюдаемые изменения в ДНК-гистограмме можно рассматривать как
проявление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки
матки (K.C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984).
Кроветворная система
При цитометрическом анализе клеточных элементов крови используют
критерии, которые включают довольно широкий спектр параметров. Это
в первую очередь цитометрические маркеры с использованием
специфических красителей на РНК, ДНК, различных ферментативных
систем (эстеразу, фосфатазу). Используются также размерные
критерии, которые включают объем, площадь, периметр и диаметр ядра
и цитоплазмы клеток, а также ядерно-цитоплазматическое отношение.
При исследовании диагностического материала при острых и
хронических формах лейкозов методами цитометрии обнаружены
некоторые различия для клеточных элементов той или иной группы
гемобластозов. Используя морфометрические методы оценки размерных
признаков ядра и цитоплазмы бластных клеток, обнаружена строгая
корреляция величины клеток и FAB (франко-американо-британской)-
классификации лейкозов. При сопоставлении количественных данных,
полученных при исследовании клеточных элементов при острых
лимфобластном и миелобластном лейкозах, классифицируемых по
морфологическим признакам на подгруппы М1 – М6 согласно FAB-
классификации, определены различия между двумя вариантами лейкозов,
кроме подгруппы М2. Регистрируемые различия в размере бластных
клеток связаны с фазами клеточного цикла. Установлено, что клетки
при остром миелобластном лейкозе в S-фазе цикла характеризуются
большим размером ядра. Для этой же форме лейкоза, но подгруппы М1
характерна более малая доля клеток в S-фазе клеточного цикла
(M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981).
Молочная железа
С целью повышения диагностических возможностей цитологического
метода при добро- и злокачественных опухолях молочной железы,
определения их гистологических вариантов, разработки
прогностических критериев заболевания – также используются данные
морфометрии и цитоспектрофотометрии. При объективизации
цитологических препаратов исходя из информативности следующих
признаков: диаметр, периметр и площадь ядра и цитоплазмы, ядерно-
цитоплазматическое отношение, текстура хроматина, содержание ДНК и
РНК. На основании цитометрических исследований установлены
некоторые закономерности, характерные для злокачественных форм
опухолей молочной железы. Это вариабельность ядерно-
цитоплазматического отношения, нарастание размера ядра и содержания
ДНК. Между двумя последними показателями обнаружена корреляционная
зависимость, характеризующаяся следующими особенностями. Показано,
что клетки с некоторой атипией, которая выражается в увеличении
площади ядра, распределяются различно по фазам клеточного цикла.
Около 21% клеток, находящихся в области 4с ДНК-гистограммы, имеют
площадь ядер свыше 125 мкм2. При площади ядер от 50 до 100 мкм2
основная масса клеток находится в G1-фазе цикла и только около 5%
клеток приходятся на гипердиплоидную область распределения ДНК
(C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985).
Показатель ДНК (количество ДНК в 1 клетке опухоли на количество ДНК
в нормальной клетке) в различных типах злокачественных опухолей
молочной железы значительно варьирует, однако чаще наблюдается
тетраплоидия (60 – 80%), доброкачественные опухоли, как правило,
диплоидные. Сравнительная оценка содержания ДНК в клетках молочной
железы при доброкачественных и раковых процессах показала
определенную зависимость между соотношением клеток по фазам цикла.
Установлено, что с прогрессированием процесса количество диплоидных
клеток в G1-фазе цикла убывает и при III – IV стадии ракового
процесса составляет 64%. Количество тетраплоидных клеток нарастает
в 2 раза и составляет около 17% общего количества клеток по
сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по
отношению к непролиферативной форме мастопатии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, как проточная, так и статическая цитометрия
позволяет исследовать многие важные параметры клеточного цикла.
Наиболее распространенной задачей, решаемой с помощью данного
класса приборов, является идентификация и подсчет клеток,
находящихся в различных периодах клеточного цикла. В последнее
время параллельно с этими параметрами с помощью цитометров
исследуют также динамику экспрессии многих важных клеточных
маркеров, что может иметь диагностическое и прогностическое
значение. Важно отметить, что принципиальных различий между двумя
типами цитометрии, по-видимому, не существует. Поэтому с помощью
достаточно простых и недорогих приборов можно воспроизводить весьма
эффективные методики исследования клеточного цикла, первоначально
разработанные для дорогостоящих проточных цитометров. Такие системы
статической цитометрии включают в себя люминесцентный микроскоп,
черно-белую или цветную телевизионную камеру высокой
чувствительности, устройство для оцифровки телесигнала и компьютер.
В последнее время в подобных системах все более широко применяются
цифровые телекамеры, которые подключаются к компьютеру через
высокопроизводительные порты нового поколения (универсальный
последовательный порт). Это позволяет создавать недорогие и
достаточно мощные системы для статической цитометрии, которые могут
успешно конкурировать как с проточными цитометрами, так с
конфокальными микроскопами. В целом можно сделать вывод о
перспективности данного направления в цитологии, дающего
возможность широкого применения методов количественной микроскопии
в научных исследованиях и клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брамберга Б.М., Зитаре И.Я., Плегере Д.П., Смилтниекс Э.Х.
Терминологический словарь морфологических признаков клетки для
автоматизации цитологической диагностики и оценки
эффективности лечения. – Рига, 1970. – 160 с.
2. Введение в количественную цитохимию. М., Мир, 1969, 439с.
3. Исаев В.Л., Пинчук В.Г., Исаева Л.М. Современные методы
автоматизированных цитологических исследований. – Киев: Наук.
думка, 1988. – 218 с.
4. Лимфоциты. Методы / под пед. Дж. Клауса-М., Мир, 393с.
5. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред.
С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999. – 558с.
6. Полетаев А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии,
молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. М., ВИНИТИ,
1989, 87с.
7. Baisch H., Gohde W., Linden W.A. (1975). Radiat. Environ.
Biophis., 12, 31.
8. Blair O.C. Winward R.T., Roti J.L. The effect of hyperthermia
on the protein content of Hela cell nuclei: A flow cytometric
analysis // Radiat. Ress – 1979. – 78. – P. 474
9. Cornelisse C.J., Van Driel-Kulker A.J., Meyer F., Ploem J.S.
Automated recognition of atypical nuclei in breast cancer
cytology specimens by iterative image transformation // J.
Microsc. (Gr. Brit.). – 1985. – 137, N 1. – P. 101 – 110.
10. Crissman H. A., Steinkamp J.A. (1990). ). In: Flow cytometry
and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L
Mendelson), pp. 227 – 247. Wiley – Liss, New York.
11. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M.R. New cell cycle
compartments identified by multiparameter flow cytometry //
Cytometry. – 1980. – 1, N 1. – P.98.
12. Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology
of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. – XIII,
Excerpta Medica. – 1981. – P. 224 – 228.
13. Enchev V.G., Tsanev K.G. Comparative cytomorphometric and
cytospectrophotometric investigations of gastric lesions //
Ibid. – 1985. – 55, N 1. – P. 37 – 46.
14. Gillett C.E., Camplejohn R.S., OґReily S.M. (1990). J.
Pathol., 160, 173A.
15. Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A.,
Musgrove E.A. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31, 1333.
16. HoddemanW., Schumann J., Andreeff M., Barlogie B., Herman
C.J., Lief R.C. et. Al. (1984). Cytometry, 5, 445.
17. Jacobberger J.W., Sramkoski R.M., Wormsley S.B., Bolton W.E.
Estimation of kinetic cell-cycle-related gene expression in G1
and G2 phases from immunofluorescence flow cytometry data/
Cytometry, 1999, 35, 284-289.
18. Laff S.A., Langolis R.J. (1990). In: Flow cytometry and
sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L
Mendelson), pp.249 – 290 . Wiley – Liss, New York.
19. Lalande M., Schreck R.R., Hoffman R., Latt S.A. Identification
of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate flow
cytometric analysis // Cytometry. – 1985. – 6, N 1. – P. 1 –
6.
20. Muller E., Weidhase R. Impulscytophotometrische Untersuchungen
zum DNS-Gehalt in Humanen Zellkernen // Wiss. Beitr. M. –
Luther-Univ. Halle-Wittenberg. – 1983. – 32, N 2. – S. 3 – 8.
21. Ormerod M.G. (ed.) (1990). Flow cytometry; A practical
approach. IRL Press, Oxford.
22. Pollack A., Moulis H., Block N.L., Irvin G.L. Quantitation of
Cell Kinetic Responses Using Simultaneous Flow Cytometric
Measurements of DNA and Nuclear Protein //Cytometry. – 1984. –
5, N 5. – P. 473 – 481.
23. Steinkamp J.A. Flow cytometry // Rev. Sci. Instrum. – 1984. –
55, N 9. – P. 1375 – 1400.
24. Tsou K.C., Hong D.H., Varello M. et. al. Flow cytometric DNA
analysis as a diagnostic aid for cervical condyloma and cancer
// Cancer. – 1984. – 54, N 9. – P. 1778 – 1787.
25. Van Dilla M.A., Trujillo T.T., Mullaney P.F., CoulterJ.R.
(1969). Science, 163, 1213.
26. Vindelov L.L., Christensen I.J. (1990). Cytometry, 11, 753.
27. Waggoner A.S. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2nd
edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 209
– 225. Wiley – Liss, New York.
