Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Биологический факультет
кафедра генетики и биотехнологии
ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Курсовая
работа
студентки 3 курса ШУТ М.В.
Научный руководитель:
канд. биол.
наук,
доцент ГЛУШЕН С. В.
Минск 2001г.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………4
1.Общие принципы проточной цитометрии ……………………..4
2. Анализ ДНК-гистограмм ……………………………………….5
3. Анализ параметров клеточного цикла………………………….9
4.Наиболее употребительные методики, используемые
в цитометрии клеточного цикла………………………………..14
5.Применение цитометрии в молекулярной
клинической диагностике………………………………………..17
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………..22
ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………..23
ВВЕДЕНИЕ
Возможности применения методов количественной цитометрии в
биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они
включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных
морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики
ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением
гетерогенных популяций исследуемых объектов. Хотя эти задачи могут
решаться на различных экспериментальных моделях или клиническом
материале, общие принципы остаются одинаковыми как для тех, так и
других объектов.
В настоящее время цитометрию принято подразделять на
проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с
помощью специальных приборов – проточных цитометров и сортеров. Для
статической цитометрии могут быть использованы конфокальные
микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа
изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах.
Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно
воспроизводить как с помощью проточной, так и статической
цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях
позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее
производительность не намного меньше проточной.
Настоящий обзор литературы посвящен применению цитометрии для
оценки параметров клеточного цикла на экспериментальном и
клиническом материале. Хотя в обзоре в основном приводятся
сведения, касающиеся проточной цитометрии, с учетом изложенного
выше они в значительной степени распространяются также и на
статическую цитометрию.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.Общие принципы проточной цитометрии
Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на
основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их
размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере,
а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измерять
интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и
определять сразу несколько клеточных параметров.
В настоящее время выпускают два основных типа приборов для
проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые
могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и
светорассеяние под углом около 10є (малоугловое прямое рассеяние) и
90є; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять
и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с
заданным набором этих параметров.
Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра
поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно
лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы
флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными
компонентами, при этом при этом может происходить одновременное
возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить
сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый
красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают
на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в
электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной
обработки и хранения информации.
Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные:
определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество
белков и количество специфических белков, узнаваемых
моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм
(например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов
кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990).
В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие
принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов,
общих для всех приборов:
- для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток;
- клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве;
- для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток,
необходимо использовать всю доступную информацию, например данные
по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его
ширине.
2. Анализ ДНК-гистограмм
Измерение содержания ДНК – одно из самых простых и
распространенных применений проточной цитометрии. Первые ДНК-
гистограммы, полученные в 1969 г.(M.A.Van Dilla, T.T. Trujillo,
P.F.Mullaney, J.R.Coulter, 1969), позволили четко различить клетки,
находящиеся в G1-, S- и G2/М-фазах клеточного цикла. С тех пор
появилось множество работ по измерению содержания ДНК в клиническом
материале, полученном в основном от больных раком.
Из ДНК-гистограмм можно получить два рода данных. Во-первых,
идентифицировать клетки с аномальным содержанием ДНК (рис.1, Б),
так называемые анеуплоидные клетки. Во-вторых, определить долю
клеток, находящихся в S-фазе (SPF), и оценить степень пролиферации.
Как правило, в клеточной популяции с высокой пролиферативной
активностью число клеток в S-фазе больше, чем обычно.
Международный комитет по аналитической цитометрии (W.Hoddeman,
J.Schumann, M.Andreeff, B.Barlogie, C.J.Herman, R.C.Lief et.al,
1984) попытался стандартизировать множество способов анализа ДНК-
гистограмм, и тем не менее для анализа продолжают использовать
различные подходы, часто с привлечением компьютерных прграмм. Далее
будут рассмотрены некоторые из этих подходов :
Вычисление коэффициента вариации (CV)
Самый простой способ оценки качества результатов основан на
вычислении CV для G1-пика ДНК диплоидных клеток. Эта величина
определяется из приведенного ниже соотношения в предположении, что
G1-пик следует нормальному распределению:
CV = W / (M · 2,35),
Где W – ширина пика на уровне полувысоты, М – номер канала для
максимума G1- пика.
Чем меньше CV и чем лучше G1-пик отвечает нормальному
распределению, тем качественнее результаты. В действительности
качество ДНК-гистограмм, как правило, не очень высоко, и чтобы
судить о достоверности результатов, полученных при клинических
исследованиях, приходится оценивать средний CV и диапазон его
значений.
Вычисление индекса ДНК
Индекс ДНК для «анеуплоидного» пика (пиков) на гистограммах с
двумя или более G1-пиками (рис.1, Б) вычисляют, ориентируясь на
«диплоидный» G1-пик. Так, на рис. 1, Б G1-пику для опухолевых
клеток соответствует вдвое большее количество ДНК, чем G1-пику
диплоидных клеток, поэтому индекс ДНК для него равен 2,0. Для
анеуплоидных клеток, содержащих на 50% больше ДНК, чем нормальные,
индекс равен 1,5. Анеуплоидию можно выявить только в тех случаях,
когда на гистограммах имеется не менее двух G1-пиков. Чтобы
установить, какой из близко расположенных друг к другу G1-пиков
соответствует диплоидным клеткам из свежих образцов ткани, можно
использовать внешний ДНК-стандарт. Если присутствуют только
диплоидные клетки, то ИД считают равным 1,0.
Основная проблема при определении плоидности связана с
трудностью выявления малого числа анеуплоидных стволовых клеток.
Еще труднее идентифицировать малочисленные тетраплоидные стволовые
клетки, поскольку такие клетки в G1-фазе по содержанию ДНК
равноценны диплоидным клеткам в фазе G2. Так, в отличие от рис 1,
Б, на котором четко виден высокий «тетраплоидный» пик, на рис.1, А
обнаруживается лишь слабый пик, соответствующий четырем гаплоидным
