Реферат: Послеоперационный спаечный процесс у гинекологических больных
Данное исследование описывает выделение и характеристику фетальных купфферовских клеток человека (ФКК). Здесь представлено, что эти клетки способны отвечать на влияние цитолинов и липонолисахаридов увеличением продукции фактора некроза опухоли-L (TNF-L) и интерлейкина - 1β (ИЛ-1β). Купфферовские клетки характеризуются: 1) морфологически; 2) после окрашивания L-нафтил оцетат эстерозой; 3) иммунофлюоресценцией с моноклональными АТ; 4) фагоцитоз капель латекса. Более чем 90% подверженных клеток определены как макродеаги.
Купфферовские клетки, культивированные с липополисахаридами, были способны продуцировать ИЛ-1β и TNF-L во время – и дозазависимой манере и максимальная секреция наблюдалась с использованием 10 мг/мл липополисахаридов в течении 8 часов обработки. Продемонстрирована зрелая функционая активность человеческих ФКК на ранних стадиях гестации (13-19 недель) и роль этих клеток в развитии и защите плода.
Купфферовские клетки, представленные большой популяцией резидентных тканевых макродеогов у взрослых, играют большую роль в антигеном процессе и разрушении, обезвреживании эндотоксинов, секреции цитокинов, медиаторы множетсва иммунных реакций, поддержание стабильности гепатоцитов и их функционировании, участие в липидном и холестериновом обмене. В лечении плода человека, как части массы тела, большая схожесть с печенью взрослых. Печень представляет ≈10% от всего веса 10-недельного плода. Печень плода человека имеет различные клеточные композиции, с ≈60% паренхинальных клеток (гепатоциты), 20% непаренхимные клетки (включая Купфферовские клетки и жировые клетки), и 220% гемолоэгических клеток.
Хотя, представленные Купфферовские клетки на ранних стадиях развития человека, хорошо описаны, их функциональная способность не совсем ясно определена.
Купфферовские клетки идентифицированы в синусоид – подобных структурах при 5-нед. гестации и были представлены в полном развитии синусов между 6 и 8 неделями. Предшественники макрофагов, происходящих из желточного мешка, выделены в фетальной печени 9-10 нед. Это доказывает, что функция этих клеток в устранении обломков при замещении одной эмбиональной ткани другой. Действительно, желточный мешок макродеогов 7-нед. гестации содержал простые эритробласты.
У взрослых, функции Купфферовских клеток хорошо известны и они играют важную роль в устранении биологически вредных материалов, включая, бактериальные липополисахариды, микроорганизмы и тромбиновые факторы. Кроме того, эндотоксины, происходящие у кишечной бактериальной флоры, являющейся нормальным компонентом портальной венозной крови, но эффективно устраняется во время прохода через Купфферовские печеночные клетки. Кроме того, ясно, что Купфферовские клетки секретируют большое количество цитокинов, что может видоизменить иммунную функцию, включая ИЛ-1β, TNF-L, гепатоцит стимулирующий фактор и интерфероны.
Предполагается важная роль ФКК в иммунном гомеостазе. Продукция печеночными макрофагами основного иммунорегулирующего пептида TNF-L может быть индуцирована эндотоксинами плода и новорожденных, показывая функциональную активность фетальных Купфферовских клеток грызунов. TNF-L проявляет различную активность, которая может колебаться от местного клеточного медиатора тканевого гомеостаза до системных физиологических процессов. Эти различия активности зависят от концентрации TNF-L в клетке, такни или системного уровня. Выделяя моноциты из связи с кровью преждевременно родившихся, значительно меньше продуцируется TNF-L при стимуляции липополисахаридами, чем моноцит у родившихся в срок, доказывая, что это снижение может способствовать ответу на увеличение чувствительности к инфекции недоношенных детей. Т. О., у беременных женщин с наличием дородовой нитроаминотической инфекции, повышается уровень TNF-L в аминотической жидкости и может быть результатом преждевременного разлива оболочек.
Мы предположили, что Купфферовские клетки, достигшие 13-19 нед. гестации должны обладать функциональной активностью, что может быть важно для развития и защиты плода. Чистота этого исследования была достигнута изоляцией и чистотой технических приемов, установкой коротких сроков культивирования, характеристикой функциональной активности и исследованием возможных активаторов ФКК человека. Очищение Купфферовских клеток может быть стимулировано продукцией TNF-L и ИЛ-1β. Мы описали количество активаторов Купфферовских клеток и обсудили возможные местные (пара- и аутокринные) и системные (эндокринные) эффекты этих секреторных медиаторов.
Результаты: Очищение фетальных Куппферовских клеток. Окончательные препараты были >95% оценены как жизнеспособные, и >90% были рассмотрены как макрофоги на основании способности захватывать латексные капли, окрашиваться L-нафтил ацетат эстерозой и иммунофлюоресценции с моноклональными антителами 3С10. Фагоцитоз множества капель в уитоплазме был зарактерен для клеток – приверженцев Купфферовских клеток. L-нафтил ацетат использовался как субстрат для открытия темно-окрашенной цитоплазмы, указывая на эстеразную активность в Купфферовских клетках. Клетки приверженцы можно было визуализировать с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции с мышиными моноллональными АТ 3С10. Более 90% этих клеток были позитивны с этим методом.
TNF-L, ИЛ-1β и LFP были количественно опдсчитаны в среде, содержащей 1*106 прилипших фетальных Купфферовских клеток, обработанных 10мг/мл липополисахаридами в теечнии 24 час. Кроме того, нами проанализированно некоторые продукты очищенных фетальных гепатоцитов в надосадочной жидкости ИЛ-1β и TNF-L продуцировались ФКК человека в большем количестве после стимуляции липополисахаридами. Гепотоциты надосадочной жидкости содержали очень низкий уровень TNF-L и ИЛ-1β с наличием и отсутствием стимуляции липополисахаридами, указывая тем самым на минимальное заражение Купфферовских клеток. Наоборот, обработка липополисахаридами не повлияло на продукцию AFP гепатоцитами.
Временное направление ИЛ-1β и TNF-L, продуцируемых Купфферовскими клетками, обработанными липополисахаридами.
Количество ИЛ-1β и TNF-L, освобожденных в культуру супернатанта, было измерено энзимсвязывающим иммуносорбентным анализом. Увеличение продукции ИЛ-1β и TNF-L было обнаружено на ранних 2-ух часах после стимуляции липополисахаридами и максимальной продукция достигалась от 6 до 8 часов.
Эффект факторов роста и цитолинов на продукцию TNF-L Купфферовскими клетками:
Для определения других факторов потенциально активных в отношении Купфферовских клеток, мы подвергли инкубационному очищению клетки со специфическими факторами роста и интерлейкинами в течение 24 часов и измерили количество TNF-L, освобожденного в культуру супернатанта. ИЛ-1β и ИЛ-1L были способны стимулировать Купфферовские клетки в концентрации ≈1,0 нг/мл.
В некоторых научных докладах указывается, что ИЛ-6 может служить как медиатор для активности ИЛ-1 в определенных клеточных типах. Мы протестировали способность ИЛ-6 активировать ФКК. Купфферовские клетки могут быть стимулированы освободившимися TNF-L, когда происходит инкубация комбинации с ИЛ-6, TNF-β и интерфероном γ, но для этого потребовалась в 20-500 раз выше концентрации. Стимулирующий эффект для освобождения TNF-L был продемонстрировал для каждого интерлейкина или интерферона при определенной дозе. Уровень эндотоксина для каждого входящего в комбинацию фактора был определен < 0,2нг/10мг. Мы не смогли обнаружить любуб продукцию TNF-L после инкубации с эпидермальным фактором роста (200 нг/мл), фактором роста, полученным на чашках Петри (200 нг/мл), инсулин-подобным фактором роста II (200 нг/мл) или ИЛ-3 (200 нг/мл).
Комментарии: Исследования функциональных способностей человеческих фетальных Купфферовских клеток ограничены. Поэтому, наш интерес, в развитии человеческого плода и особенно в изучении функционирования печени плода, мы почувствовали, что для этого было важным развивать отдельные технологии для исследования и характеристики фетальных Купфферовских клеток. Мы представили здесь методы для изоляции Купфферовских клеток плода человека > 90% чистоты. Мы охарактеризовали морфологические особенности этих клеток, окрашивая L-нафтил ацетат эстеразой и иммунофлюоресцентным окрашиванием с мышиными моноклональными АТ, зная реакцию с человеческими макрофагами и моноцитами. Мы не полагаем, что препараты были загрязнены периферическими моноцитами < 0,5%, т.к. прилипшие клетки узнавались анти-Len-M1, а мышиные моноклональные АТ характеризовались реакцией с 90% циркулирующих человеческих моноцитов, но не с тканевыми микрофогами. Кроме того, < 1% наших прилипших клеток были узнаваемы 3 моноклональными АТ, что обнаруживает высокую плотность определенных человеческих Т-клеток.
На основании наших оценок ≈1%-2% клеток, представленных в печени плода человека 13-198 недель гестации, это Купфферовские клетки. Наши оценки подтверждаются окрашиванием L-нафтил ацетат эстеразой и иммунофлюоресцентным окрашиванием с мышиной моноклональными АТ 3С10 но замороженных срезах и препаратах интактной печени плода. Эти оценки соглазуются с результатами морфометрического анализа печени крыс в электронном микроскопе, который определил, что 2,1% объема печени была представлена Купфферовскими клетками. Кроме того, исследования демонтрируют, что все гематопоэтические клетки могут рассматриваться в качестве значительной пропорции от массы печени плода в течении 10-12 недель гестации; около 1-2% клеток были представлены макрофогами. При окрашивании замороженных тканевых срезов печени плода человека 10-20 недель гестации мышиными моноклональными АТ класса II, оценка позитивных клеток составила 0,3% и 7,7%. Некоторые различия в оценке количества Купфферовских клеток приписывают макрофагам в печени плода, выполняющей функцию их созревания. Эти находки указывают на развитие процесса созревания Купфферовских клеток в 10-20 недельный срок гестации и могут объяснить такие наши наблюдения, что 5% прилипших клеток не могут быть распознанными любыми моноклональными АТ против макрофагоф или моноцитов, использованных в этом исследовании.
