Курсовая работа: Cигнальные пути клеток в онтогенезе животных
Достаточно хорошо изучен трансмембранный белок лиганда Delta. Он тоже обнаруживается в разных тканях эмбриона, в том числе во всех клетках пронейральных кластеров, крыловом диске. В нем выделяют N-сигнальный терминальный участок, необходимый для транспорта через мембрану, большой внеклеточный домен с девятью повторами EGF-подобного фактора и относительно короткий внутриклеточный домен. В культуре шнейдеровских клеток (S2) методом иммунофлюоресцентного специфического к внеклеточному домену белка окрашивания показана локализация Delta на клеточной поверхности. На поверхности клеток S2 после одновременной трансфекции конструкциями, включающими оба гена, Notch и Delta, наблюдается сходство в распределении Delta и Notch. Коиммунопреципитация к белковым экстрактам из таких S2 клеток и клеток эмбрионов показывает, что Notch и Delta образуют прочный межмолекулярный комплекс. Все это верно не только в случае экспрессии в клетках полной последовательности, но и в случае экспрессии части Notch с почти полностью удаленным внутриклеточным доменом (Doherty et al., 1996). Полученные данные о структуре и клеточной локализации Notch и Delta, их взаимодействии in vitro, функциональных особенностях разных доменов белков дают основания для построения схемы взаимодействий компонентов каскада и понимания механизмов передачи сигнала с поверхности клетки в ядро.
Белок лиганда Serrate играет сходную, но комплементарную роль с Delta в крыловом диске. Они действуют как компартмент-специфические лиганды на дорзовентральной границе во время роста крыловой пластины и формирования края крыла: Serrate – в дорзальном, а Delta – в вентральном отделах связывают одни и те же EGFL-повторы Notch. Структура последовательности белка лиганда Ser обнаруживает большое сходство с Dl, имея сигнальный пептид, 14 повторов EGF-подобного фактора в ее внеклеточном районе, внутримембранный домен и совсем маленькую внутриклеточную часть. Экспрессия трансмембранного белка Ser обнаруживается в области формирования края крыла в имагинальном диске (Fleming et al., 1990). Показано, что клетки S2, экспрессирующие Ser, образуют агрегаты с клетками, экспрессирующими Notch (Speicher et al., 1994). В обобщенных для разных животных схемах пути Notch сходные по структуре и функции белки Delta и Serrate у Drosophila melanogaster и Lag2 у C. elegans объединяют в одно семейство DSL трансмембранных лигандов.
Усилиями многих исследовательских групп за последнее десятилетие показано, что под воздействием связывания с лигандами изменяется конформация белка рецептора Notch, и он становится субстратом для различных протеаз. Металлопротеазы из семейства ADAM расщепляют рецептор во внеклеточном домене, оставляя в его молекуле 11–12 аминокислот от внеклеточного домена. Внутриклеточный домен после этого остается прикрепленным к клеточной мембране. Относительно недавние данные позволяют связывать такое расщепление рецептора Notch у Drosophila melanogaster с металлопротеазой Kuzbanian (Lieber et al., 2002). Есть и другие мнения о роли в цепи передачи Notch-сигнала трансмембранного белка Kuzbanian. Одни считают вероятным его участие в протеолизисе внеклеточной части Notch-белка на стадиях созревания рецептора и продвижения его к клеточной мембране, необходимых для взаимодействия Notch-рецептора с лигандами. Образующийся после этого посредством дисульфидных мостиков димер Notch теряет внутреннюю часть EGF-повторов во внеклеточном домене (Pan, Rubin, 1997). Другие предполагают, что Kuz на поверхности секретирующих клеток участвует в процессинге Delta, свобождающем его внеклеточный домен для связывания с Notch (Qi et al., 1999). Характер генетических взаимодействий kuz и N, Ser, E(spl)m8 и H, позволил предположить, что трансмембранный Kuz участвует в цепи передачи Notch-сигнала на стадии, предшествующей Su(H). Kuz экспрессируется в эмбриональной нейроэктодерме и личиночном глазном имагинальном диске.
На следующем этапе процессинга рецептора наблюдается расщепление во внутримембранном домене белка или в непосредственной близости от мембраны. На основании полученных на сегодняшний день данных лучшим кандидатом на участие в этом внутримембранном расщеплении считается фермент Presenilin (PS). Известно, что белки PS и Notch физически ассоциируют между собой и образуют комплекс в клеточной мембране (Ray et al., 1999). Иммуноокрашивание PS– и нормальных глазных дисков показывает, что субклеточная локализация и распределение Notch и Delta y них примерно одинаковы. В то время как уровень Notch-белка и его локализация в клеточной мембране у PS–-эмбрионов не отличается от дикого типа, транспорт внутриклеточной части Notch в ядро зависит от генотипа по PS. Использование конструкций с сигнальными генами показало, что активированная форма Nint, в которой делетированы внеклеточная и трансмембранная части белка, достигает ядер в отсутствие активности PS. Белок NEGF, в котором удален только внеклеточный район, не накапливается в ядрах PS–-эмбрионов (Ye et al., 1999; Mumm, Kopan, 2000; Struhl, Greenwald, 2001). В результате контролируемого ферментом PS протеолизиса в районе внутримембранного домена внутриклеточная часть белка Notch освобождается от мембраны и приобретает способность передвигаться и доставлять сигнал в ядро (Struhl, Adashi, 1998; Mumm, Kopan, 2000). В свою очередь, экстраклеточный домен белка Notch подвергается транс-эндоцитозу в клетках, экспрессирующих лиганд (Parks et al., 2000).
Активированный внутриклеточный домен белка рецептора Notch при участии анкириновых сdc10 повторов связывается с регуляторами транскрипции группы CSL (CBF1, Su(H), Lag-1), к которым относится Su(H) у Drosophila melanogaster. Белок Su(H) в культуре клеток S2, несущих конструкцию с полноразмерной копией Su(H), локализуется преимущественно в ядре. После одновременной трансфекции в S2 полноразмерных копий генов Su(H) и Notch белки Su(H) и Notch обнаруживаются в цитоплазме с одинаковой вариацией их относительных уровней в различных частях клетки. В случае когда трансфекция выполнена с использованием последовательности Notch-локуса, делетированной по сdc10-району, колокализация белков не наблюдается и Su(H) первоначально концентрируется в ядре. В системе трансформированных дрожжей полноразмерный белок Su(H) ассоциируется с внутриклеточным сегментом Notch, если только он содержит все 6 cdc10-повторов. В смешанной S2 культуре, когда клетки, экспрессирующие Su(H) и Notch, агрегируют с клетками, экспрессирующими Dl, цитоплазматическая локализация Su(H) и Notch меняется на ядерную
В отсутствие активности внутриклеточного домена Notch белок Su(H) в агрегате с комплексами корепрессоров выступает в роли репрессора транскрипции генов. Notch действует как антагонист этого объединения. Связываясь в цитоплазме или ядре с корепрессорами и с Su(H), Notch вызывает каскад взаимодействий Su(H) с рядом других белков и переключение Su(H) на роль активатора транскрипции (Mumm, Kopan, 2000).
В ядре Su(H) запускает гены-мишени комплекса E(spl), белки которых вместе с продуктами генов-мишеней Notch-пути у разных животных объединены в класс HES (от Hairy и E(spl)). В опытах с последовательностями Su(H) разной длины определена примерная протяженность области белка, необходимая для связывания с ДНК. Способность Su(H) распознавать сайт связывания ДНК теряется после образования белок-белкового комплекса Н-Su(H). Обнаружен участок Su(H) для прямого взаимо-действия с Н in vitro. Увеличение in vitro концентрации Н коррелирует с ослаблением связывания между Su(H) и ДНК, когда их количество не меняется (Brou et al., 1994; Barolo et al., 2002).
Белки 7 нейрогенов комплекса E(spl) содержат bHLH-мотивы, способные к образованию гомо- и гетеродимеров и к связыванию со специфическими последовательностями ДНК. Их относят к группе негативных регуляторов транскрипции. Транскрипты E(spl) экспрессируются в определенной динамике в эмбриогенезе и на личиночных и куколочных стадиях. Нейрогенные локусы комплекса транскрибируются в нейроэктодерме, в крыловом имагинальном диске в местах будущего формирования сенсорных органов, вблизи дорзовентральной границы крыла, в местах формирования жилок пластины крыла, во всей морфогенетической бороздке глазного диска, в яичниках взрослой самки (Knust et al., 1987). С потерей функции Notch или Delta нарушается нормальная аккумуляция белков E(spl)bHLH в ядрах клеток вентральной нейроэктодермы (Jennings et al., 1994).
Каскад событий Notch-сигнального пути завершается включением E(spl). В свою очередь, белки-репрессоры E(spl)bHLH предотвращают клетки в пронейральных кластерах эктодермы от развития по нейральному пути, ингибируя пронейральные гены achaete, scute, lethal of scute (Jennings et al., 1994; Heitzler et al., 1996).
Аналогично действию в нейрогенезе Notch-путь контролирует судьбу недифференцированных бипотентных клеток-предшественниц в оогенезе. Напротив, во время развития крыла и глаза Notch-путь может выполнять не ингибирующую, а индуктивную функцию (Mumm, Kopan, 2000; Portin, 2002).
Взаимодействие Notch-пути с другими генами и сигнальными каскадами (сеть сигнальных путей)
Плейотропное действие Notch предполагает его взаимодействие с другими генами, модулирующими его активность и не входящими в Notch-сигнальный путь. Данные генетических экспериментов на Drosophila melanogaster позволяют предполагать влияние генов wingless и Notch на функции друг друга. Недавние биохимические эксперименты доказали наличие прямого физического контакта между Wingless и Notch, не приводящего к расщеплению молекулы Notch. Кроме того, Notch взаимодействует с Dishevelled, участником Wg-каскада (Axelrod et al., 1996). Интересно, что внутриклеточный домен Notch может образовывать белковый комплекс не только с Su(H), но и с другими регуляторами транскрипции, такими, как ацетилазы гистонов (Klein et al., 2000).
Наблюдаемые взаимодействия между генами и их белками, возможно, отражают взаимосвязь между известными сигнальными путями, наличие сети сигнальных путей. Например, приобретение нейрального статуса предшественниками нейронов в глазном имагинальном диске происходит под контролем и при взаимодействии передающих каскадов Hh и Notch. Белок Nоtch выступает в роли регулятора негативных репрессоров транскрипционного фактора Atonal, зависящего опосредованно от Hh-пути через секретируемый белок Dpp из семейства TGFЯ (Baonza, Freeman, 2001). Дифференцировка клеток-предшественниц сенсорных макрохет мезоторакса связана с антагонистическими отношениями между EGFR- и Notch-сигнальными путями (Culi et al., 2001). Координированные взаимодействия систем, образующих сигнальную сеть, являются основой согласованной регуляции функционирования генома живых организмов. Нарушение передачи сигнала на каком-либо этапе приводит к различным патологиям, из которых у позвоночных наиболее известны такие, как болезнь Альцгеймера, заболевания различными типами рака и другие (Гилберт, 1995; Ray et al., 1999).
