Быстрый поиск

Статья: Биофизика фотобиологических процессов

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Одной из важнейших фундаментальных проблем биофизики является расшифровка механизмов первичных процессов действия света на разные биологические системы. Свет является одним из ключевых факторов среды обитания большинства организмов. Рецепция света и трансформация его энергии лежит в основе зрения, фотосинтеза и ряда фоторегуляторных процессов у растений, в инициации которых участвуют специализированные фоторецепторы, например, родопсин, хлорофилл, фитохром, фототропин, криптохром. Поглощая свет определенного спектрального диапазона, фоторецепторы вступают в фотохимические реакции с образованием первичных фотопродуктов. Последние участвуют в биохимических процессах клеточной регуляции, что приводит к развитию конечных фотобиологических эффектов. В то же время свет индуцирует протекание в клеточных структурах различных деструктивных фотохимических реакций, природа и эффективность которых зависит от длины волны и интенсивности излучения, наличия соответствующих фотоактивных хромофоров и их внутриклеточной локализации, а также способности клеток к фотозащите и репарации фотоповреждений. Наиболее эффективно деструктивные реакции индуцируются высокоэнергетическим ультрафиолетовым (УФ) излучением (‹290 нм). Экологическими компонентами оптического излучения солнца яаляются средневолновый УФ (СУФ, 290—320 нм), длинноволновый УФ (ДУФ, 320—400 нм) и видимый свет (400—700 нм). Уменьшение концентрации стратосферного озона ведет к повышению интенсивности СУФ, который за счет прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками вызывает образование в них повреждений, обусловливающих цитотоксические, мутагенные и канцерогенные эффекты. ДУФ и видимый свет, которые макромолекулами непосредственно не поглощаются, могут индуцировать деструктивные реакции за счет фотосенсибилизации с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов (хромофоров), способных в фотовозбужденном состоянии реагировать с биосубстратами с образованием реакционноспособных радикалов или генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Молекулярная фотобиология

Исследования в этой области связаны с изучением фундаментальных механизмов воздействия света на клетки дрожжей и бактерий. Основная проблема состоит в выявлении фотоиндуцированных реакций и изучении природы светочувствительности живой клетки при воздействии оптического излучения. В центре внимания — экспериментальное решение следующих вопросов:

какие потенциально фотоактивные хромофоры (сенсибилизаторы) могут вступать в фотохимические реакции в клетке, не содержащей специализированные фоторецепторные системы;

какова природа первичных фотопродуктов, ответственных за развитие конечного фотобиологического эффекта;

какое значение для протекания фотореакций и проявления эффекта имеют внутриклеточная локализация фотоактивного хромофора и его молекулярное микроокружение;

какие механизмы могут лежать в основе фотоиндуцированной модификации цитотоксических эффектов оптического излучения, которая наблюдается при комбинированных воздействиях света разной длины волны и интенсивности.

Исследования, проведенные на клетках дрожжей, позволили обнаружить, что низкоинтенсивный монохроматический свет в диапазоне 290—380 нм индуцирует два различных фотобиологических эффекта в зависимости от дозы облучения: фотозащиту от УФ-инактивации и фотостимуляцию размножения клеток. Оба эффекта основаны на фотомодуляции активности фермента, катализирующего синтез серотонина — метаболита, у которого были обнаружены ранее не известные функции — протектора ДНК от УФ-повреждений и регулятора клеточного деления. При более высоких интенсивностях и дозах ДУФ- излучение вызывает летальный эффект, в основе которого лежат фотодинамические реакции. Показано, что функцию эндогенного сенсибилизатора выполняет локализованный в ядре клетки НАДН. Установлена способность НАДН фотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода с последующим образованием перекиси водорода и гидроксильного радикала, который непосредственно участвует в формировании одноцепочечных разрывов ДНК. Кратковременное воздействие видимого света в малых дозах (максимум эффективности в красной области спектра при 680 нм) индуцирует защитный эффект в условиях инактивирующего облучения клеток СУФ и ДУФ. Установлено цитотоксическое действие видимого света, опосредованное эндогенным сенсибилизатором протопорфирином. В условиях индуцированного накопления в митохондриях клетки высокого уровня сенсибилизатора и последующей его релокализации в плазматическую мембрану и ядро наблюдается многократное увеличение летального эффекта вследствие взаимодействия деструктивных процессов, протекающих в этих структурах.

В качестве первоочередной задачи при изучении молекулярного механизма обнаруженного фотозащитного эффекта, индуцированного красным светом, необходима идентификация фоторецептора, опосредующего этот эффект. Полученные ранее данные дают основания предполагать, что фоторецептором в дрожжевой клетке может служить хромопротеид, аналогичный фитохрому — универсальному фоторегуляторному пигменту растений. У микроорганизмов функциональная роль фитохрома пока не определена, хотя гены, кодирующие апофитохром, недавно найдены у некоторых бактерий и грибов. Другая задача связана с изучением молекулярных основ фотосенсибилизирующей активности и фотолабильности эндогенного протопорфирина, участвующего в фотодинамической инактивации дрожжевых клеток, в зависимости от молекулярного микроокружения.

Молекулярные механизмы фотосинтеза

Важнейшей фундаментальной проблемой биофизики является изучение фотосинтеза — процесса преобразования световой энергии солнца в химическую энергию тканей фотосинтезирующих организмов. В первичной (световой) стадии энергия поглощенных квантов света используется для разрыва химических связей восстановителя (в случае высших растений — для фотолиза воды), а часть ее, в конечном счете, запасается в новых химических связях. В последующей (темновой) стадии фотосинтеза запасенная энергия используется для восстановления углекислоты до сахаров в восстановительном пентозофосфатном цикле, осуществлящем создание органического вещества из неорганического. Первичные процессы фотосинтеза включают несколько этапов: поглощение света хлорофиллом антенного комплекса, миграцию энергии поглощенных квантов к реакционным центрам (РЦ) фотосистем, фотохимическое разделение зарядов, перенос электронов по фотосинтетической электрон-транспортной цепи, сопряженный с запасанием энергии в виде химических связей конечного восстановленного продукта — восстановленного НАДФ, а также АТФ.

Поскольку разные этапы первичных процессов фотосинтеза протекают в разных компартментах фотосинтетической мембраны и характеризуются различными временами, для понимания механизма процесса фотосинтеза необходимы исследования, проводимые специалистами разного профиля и использованием объектов разной сложности — от изолированных макромолекулярных белковых и пигмент-белковых комплексов, различных субхлоропластных частиц, хлоропластов, фотосинтезирующих клеток водорослей до нативных растений. Это требует сотрудничества фотофизиков, биохимиков и физиологов растений. Кроме того необходима лабораторная техника, позволяющая исследовать процессы в разном временнóм диапазоне.

Ключевой энергопреобразующей структурой в фотосинтезирующих организмах являются реакционные центры фотосистем, встроенные в фотосинтетические мембраны пигмент-белковые комплексы, выполняющие за счет энергии света высокоэффективный (квантовый выход — до 100 %) и очень быстрый (менее 1 нс) трансмембранный перенос электронов против направления термодинамического потенциала, в результате чего, в конечном итоге, и запасается солнечная энергия.

В проводимых исследованиях используются различные современные методы кинетической абсорбционной и люминесцентной спектрофотометрии широкого временного диапазона регистрации, ЭПР, ЯМР, ядерный гамма-резонанс, современные подходы теоретического анализа получаемых результатов и построения адекватных физических моделей процессов. Имеется биохимическая база для получения высокочистых активных фотосинтетических препаратов различного состава, включая изолированные мембранные белково-пигментные комплексы разного уровня организации. Основными методами изучения механизмов преобразования световой энергии в первичных стадиях фотосинтеза являются:

измерение кинетик затухания флуоресценции (импульсная флуориметрия) с временным разрешением до 10 —12 с;

лазерная абсорбционная спектроскопия фемто-, пико- и наносекундного (10 —14 — 10 —8 с) диапазона, позволяющая исследовать последовательность и скорости реакций преобразования энергии кванта света в энергию электрохимического потенциала;

спектроскопия комбинационного рассеяния света, позволяющая изучать природу химических связей синтезированных под действием света соединений;

широкий спектр традиционных методов оптической спектроскопии, спектроскопии переходных процессов, компьютерного моделирования и радиоспектроскопии.

Методами импульсной флуорометрии и абсорбционной спектроскопии высокого (10 —14 — 10 —8 с) временного разрешения исследуются процессы миграции энергии электронного возбуждения в антенных пигмент-белковых комплексах, захвата возбуждения фотоактивным пигментом РЦ — первичным донором электрона, и темновые реакции разделения зарядов и переноса электрона в акцепторной цепи электронного транспорта. Показано, что белки, содержащие пигменты антенны и кофакторы, за времена менее 10 —12 с способны осуществлять тонкую подстройку начальных и конечных состояний донора и акцептора энергии (электрона). В самый начальный момент времени возникает неравновесное начальное состояние донора энергии (электрона). В результате процесса сольватации с участием водородных связей происходит понижение уровня энергии донора и формирование наиболее выгодной конфигурации потенциальной поверхности для реактантов. Как следствие, вероятность обратных (бесполезных) реакций падает, а эффективность прямых энергетически выгодных реакций существенно возрастает.

Страницы: 1, 2