Реферат: История и методология клонирования
Реферат: История и методология клонирования
Эта тема прекрасно отражена в статье Конюхова Бориса Владимировича - доктора биологических наук, заведующего лабораторией генетики развития Института общей генетики имени Н.И. Вавилова. Здесь я просто приведу её текст :
Долли - случайность или закономерность?
Термин "клон" происходит от греческого слова "klon", что означает - веточка, побег, черенок, и имеет отношение прежде всего к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками, почками или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. Начиная с 70-х годов нашего столетия для клонирования растений стали широко использовать небольшие группы и даже отдельные соматические (неполовые) клетки.
Дело в том, что у растений (в отличие от животных) по мере их роста в ходе клеточной специализации - дифференцировки - клетки не теряют так называемых тотипотентных свойств, т.е. не теряют своей способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому практически любая растительная клетка, сохранившая в процессе дифференцировки свое ядро, может дать начало новому организму. Эта особенность растительных клеток лежит в основе многих методов генетики и селекции.
При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений. Все организмы, входящие в состав определенного клона, имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаются между собой.
Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом - одно из существенных их отличий от клеток растений. Как будет показано ниже, именно здесь - главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных.
Первые опыты на амфибиях
Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки [1]. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах.
Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика [2]. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей (рис. 1). Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.
Позже Гердон модифицировал эксперимент [3]. Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется "серийной пересадкой" в отличие от "первичной пересадки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.
Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер [4]. Примерно 25% первично реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика.
В сною очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра недслящихся и полносгью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens [5]. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше стадии головастика не развивались.
Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей.
Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией неработающих генов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, дифференцировка становится необратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже ядро. Однако наряду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат малодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для клонирования млекопитающих.
Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.
Неудачи экспериментов с мышами
Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих работ отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично. К тому времени, замечу, весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.
Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы [6] из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии бластоцисты [7].
6. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период после проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из хромосом яйцеклетки.
7. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий развития, еще до его имплантации в матку.
В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели голько магеринский, а две - отцовский геном [8]. Это, якобы, зависело от гого, какой пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи но типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с гем, что, удаляя один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомочиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.
Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются десятки лет работы.
Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.
Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты [9].
Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей [10]. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию [11]. С другой стороны, рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона [12].
