Курсовая работа: Источники и пути образования оксида азота в организме

Наиболее чувствительным среди методов определения NO в организме или в клеточных системах является электрохимический метод. Он основан на каталитическом окислении оксида азота полимерным металлопорфирином (полупроводником n-типа), которое протекает при 630 мВ. Диаметр электрода может достигать 0,2 мкм, что позволяет измерять внутриклеточное производство оксида азота. Поскольку время ответа электрода составляет около 10 мс, часть радикалов, вступающая в очень быстрые реакции (например, с супероксид-радикалом), не может быть зарегистрирована [15]. С помощью этого методы были проведены измерения содержания оксида азота в крови человека [1].

Хемилюминесцентный метод основан на регистрации фотонов, излучаемых в реакции NO с озоном. Несмотря на высокую чувствительность, применение его к биологическим объектам затрудняется сложным этапом доставки радикала в анаэробную газовую фазу. Кроме того, на выход люминесценции оказывают влияние аммиак, олефины, окислы серы и другие продукты, выделяющиеся в результате биологической активности организма и часто содержащиеся в стенках аппаратуры [1].

Среди непрямых методов определения NO (таблица 3) наиболее распространенным методом оценки его синтеза является реакция на нитрит-анион с использованием реагента Грисса (раствор сульфаниламида и N-(1-нафтил) -этилендиамида в 2,5%-ной ортофосфорной кислоте), которая дает окрашенный дазопродукт с максимумом поглощения при 548 нм. Обычно отношение содержания NO-2/NO-3 у млекопитающих составляет 1 : 10. и хотя содержание нитрит-аниона менее подвержено влиянию состава питания, при необходимости более полного определения продукции оксида азота измеряют и содержание нитрат-аниона. Для этого NO-3, выделяющийся в культурную среду или биологические жидкости, восстанавливают металлическим кадмием, импрегнированным медью, или ферментативно, нитратредуктазой [1].

Таблица 4. косвенные методы определения оксида азота [1].

* ФТИО – 2-(4-карбокифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-3-оксид-1-оксил;

ТНС – тетразолий нитросиний;

ГЦ – гуанилатциклаза.

Высокую чувствительность имеет метод, основанный на фотометрии метгемоглобина, образующегося в результате окисления оксигемоглобина NO. Применения двухволновой спектрофотомерии дает возможность определять до 2 нМ оксида азота [9]. В качестве субстратов также могут быть использованы дезокси- и карбоксигемоглобин. Серьезным недостатком, ограничивающим применение этих методик, является необходимость очистки исследуемых объектов от эндогенного гемоглобина, а также соединений, способных его окислять[1].

Как известно, оксид азота образуется из L-аргинина в эквимолярном отношении с L-цитруллином. На этом основан радиометрический метод определения NO по появлению L-цитруллина, меченного радиоактивной меткой, происходящей из L-аргинина. В определенных условиях для оценки синтеза цитруллина может быть полезной колориметрическая реакция на карбаминогруппу. Другой необходимый компонент синтеза NO - НАДФ.Н. разница в скорости его окисления в присутствии и в отсутствии ингибитора NO-синтазы может служить показателем синтеза NO. Подобный метод применяется в гистохимии, где регистрируется НАДФ.Н-зависимая диафоразная активность NO-синтазы в присутствии и в отсутствии ее ингибиторов [1].

В качестве показателя синтеза NO в клеточных экстрактах также используется универсальная способность этого радикала увеличивать активность гуанилатциклазы в 10-50 раз. Ряд методов основан на измерениях физиологических реакций, инициируемых NO, таких как релаксация сосудов, ингибирование адгезии тромбоцитов и др. [1].

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8