Свечение сопровождающее биологические реакции

первыми объектами были цельная кровь и плазма крови больных людей.

Поскольку собственное свечение было очень слабым и измерять его было

трудно, было сделано много попыток усилить это свечение: к плазме крови

добавляли красители, перекись водорода, ионы двухвалентного железа и т.д.

[4]. Природа химических реакций, обусловливающих свечение, была понятна

далеко не всегда, но авторов предложений это не слишком беспокоило: лишь бы

была разница между больными и здоровыми, а еще лучше между разными группами

больных. Скорее удивительно, что при ряде патологий разница была довольно

существенной. Пожалуй, наибольшее число публикаций в литературе посвящено

свечению плазмы крови, к которой для инициирования цепного окисления

липидов добавляли соли двухвалентного железа. Амплитуда сигнала

хемилюминесценции хорошо коррелировала с количеством продуктов перекисного

окисления липидов, определяемых химическим методом, и зависела от липидного

состава плазмы крови и концентрации в ней антиоксидантов, то есть веществ,

тормозящих процессы, идущие с участием

свободных радикалов. Во многих случаях данные таких анализов были признаны

ценными в качестве дополнительных при постановке врачом диагноза

заболевания, контроля за эффективностью лечения и прогноза течения болезни.

Все же измерение неактивированной хемилюминесценции в широкую клиническую

практику пока не вошло в отличие от хемилюминесценции в присутствии

активаторов.

В присутствии определенных соединений, обычно называемых в

отечественной литературе "активаторами", свечение клеток и тканей может

быть усилено на несколько порядков величины. Наибольшее распространение

получило измерение хемилюминесценции, связанной с выделением клетками

активных форм кислорода (к которым относятся супероксид, гидроксильный

радикал, перекись водорода и гипохлорит): хемилюминесценция наблюдается в

присутствии активаторов люминола и люцигенина. Активированная

хемилюминесценция довольно широко применяется в клиническом биохимическом

анализе.

Активированная хемилюминесценция

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в

клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не

случайно получила название "сверхслабого свечения" . Это оказалось главным

и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию

собственной хемилюминесценции в аналитических целях.

Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции

в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной

литературе общее название "активаторов", а за рубежом - "усилителей"

(enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются

на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать

химическими и физическими активаторами .

Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с

активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе

которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное

состояние., что приводит к высвечиванию фотонов:

Активатор + радикалы > продукт* > продукт + фотон

Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить

люминол (3-аминофталевый гидразид, см. Рис. 4) и люцигенин [Бис(N-

метилакридиний)] Физические активаторы не вступают в химические реакции и

не влияют на ход реакций, сопровождающихся hemilumм, но тем не менее

многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия

лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы

продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы > продукт* > продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор > продукт + активатор* > фотон 2 (активированная ХЛ)

Хемилюминесцентный иммунный анализ

По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от

радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных

субстратов или антител используются субстраты и антитела,"меченные"

соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся

хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно

это фермент пероксидаза).

Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат

низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и

люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры

акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится

либо к антигену, т. е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на

этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno

Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски это

соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-

ХемилюминоМетрический Анализ).

Оба метода направлены на определение биологически-важных

низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как

правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.

При использовании метода CIA к раствору, содержащему интересующее нас

анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное

количество того-же, но ХЛ-меченного соединения (обозначим его как A*) и

антитела (анти-A). Образуется смесь меченных и немеченных иммунных

комплексов (A-анти-A и A*-анти-A, соответственно):

A + A* + анти-A > A-анти-A + A*-анти-A.

Очень важно, что пропорция между меченным и немеченым иммунными

комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и

сколько немеченого было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было

немеченого антигена, тем меньше доля меченных антител.

Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить

количество A*-анти-A по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем

меньше, чем больше было немеченых антигена A (т. е. анализируемого

вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным,

предварительно строят калибровочную кривую, т. е. измеряют зависимость

интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора

изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с

неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по

калибровочной кривой находят концентрацию A.

При использовании метода ICMA берут избыток ХЛ-меченного антитела (анти-

A*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-

меченный иммунный комплекс:

A + анти-A* > A-анти-A*

Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и

измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше

было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь

предварительно строят калибровочную кривую.

В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных

комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы

здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в

использовании порошка сорбента (см. Рис. 6 В), к поверхности которого

"пришиты" (т. е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к

анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-

анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-

А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и

затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество

меченного антигена.

Биолюминесценция

Биолюминесценция - (БЛ) - это hemilum живых организмов, видимое простым

глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным

систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм

реакций, сопровождающихся hemilumм, весьма различен у разных видов; однако

обычно включает в себя химическое превращение определенного

низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое

ферментом, называемым люциферазой.

С развитием техники измерения очень слабых световых потоков стало

ясно, что свечение при химических реакциях (хемилюминесценция) - не такая

уж экзотика. Слабое свечение сопровождает по существу все химические

реакции, идущие с участием свободных радикалов. Собственное свечение

животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакциями цепного

окисления липидов и реакциями, сопровождающими взаимодействие окиси азота и

супероксидного радикала.

Известное с древних времен видимое простым глазом свечение некоторых

организмов, например светляка, которое называют биолюминесценцией, также

нашло широкое применение в клинических анализах и медико-биологических

научных исследованиях.

Биолюминесценция светляка

Всем известное hemilum светлячков происходит в результате биохимической

реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии

аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):

|E + LH2 + ATP > E-LH2-AMP + PP |

|E-LH2-AMP P*-E-AMP > E + P + AMP + фотон |

Здесь AMP - аденозинмонофосфат, PP - пирофосфат, E - люцифераза, LH2 -

люциферин, P* и P - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и

основном состояниях, соответственно.

В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один

из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для

определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе,

к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из

светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии.

Удается определять содержание АТФ в образце от 10-17 моля и выше.

Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности

клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения

бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности

эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы

антибиотиков и т В последнее время используют препараты иммобилизованной

люциферазы (т. е. фермента, молекулы которого химически связаны с

полимерной пленкой), стабильность которой выше; такой препарат можно

использовать многократно.

Биолюминесценция светящихся бактерий

К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная

реакция, непосредственно сопровождаемая hemilumм, катализируется ферментом

— бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления

восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно -

алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты В последние

годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых

в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в

суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент -

люциферазу.

Прежде всего, измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для

определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие

кислорода фотобактерии не обладают hemilumм, hemilum усиливается

пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О2

от 2•10-8 до 5•10-6 моль/л.

Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного

животного", т. е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие

различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к

примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно

использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем

ионами тяжелых металлов.

С другой стороны, hemilum бактерий можно использовать для

предварительной оценки эффективности новых антибиотиков. Но наиболее

перспективно, несомненно, применение очищенных препаратов бактериальной

люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений,

обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех

субстратов: кислорода, ФМН-Н2 и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи

не менее 8 углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной

люциферазе ФМН-Н2, исследователь получает высокочувствительную систему для

определения алифатических альдегидов; к их числу принадлежат, в частности,

половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10-

14 моль, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи.

Биолюминесценция медузы Aequorea

В последнее время для обнаружения малых количеств ионов кальция широко

используется хемилюминесценция белка, выделенного из медузы Aequorea. Этот

фотопротеин, называемый акворином, содержит в себе ковалентно связанный

люциферин, который в присутствии ионов Са2+ подвергается химическим

превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.

Вследствие малой инерционности и высокой чувствительности биолюминесцентный

метод весьма эффективен при изучении высвобождения и связывания Са2+ в

биологических системах, например, во время мышечного сокращения. При этом

экворин добавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности

биолюминесценции следят за динамикой изменения содержания свободного

кальция.

Заключение

Подобно многим другим разделам науки, хемилюминесценция и

биолюминесценция вначале были объектом исследования, а потом стали методом

исследования других объектов. На сегодняшний день химические и физические

явления, лежащие в основе чудесного превращения энергии биохимических

реакций в световое излучение, в основном расшифрованы.

Началось более или менее широкое использование хеми- и

биолюминесценции в биохимических лабораторных и клинических исследованиях.

Создаются серийные приборы - хемилюминометры и биолюминометры, выпускаются

наборы реактивов для анализа определенных антигенов, антител и ферментов в

крови больных и в других биологических жидкостях. Ведется поиск новых

соединений, обладающих способностью вступать в химические реакции,

сопровождающиеся hemilumм, с химически-активными продуктами

жизнедеятельности живых клеток, такими как свободные радикалы и пероксиды

(химические активаторы ХЛ), равно как и веществ, усиливающих квантовый

выход хемилюминесценции (физические активаторы ХЛ).

Одновременно с этим расширяется применение в аналитических целей

методов биолюминесценции. Прогресс органической химии, молекулярной

биологии и биотехнологии избавил нас от необходимости путешествовать на юг,

чтобы ловить по ночам светляков, или охотиться в океане за медузами, чтобы

выделить из живых существ фермент люциферазу и субстрат биолюминесцентных

реакций - люциферин: люциферины научились синтезировать, а многие

люциферазы можно получить сейчас методами генной инженерии. Короче говоря,

применение методов хеми- и биолюминесценции безусловно поможет пролить свет

на многие загадки, еще не решенные учеными.

Страницы: 1, 2