Настоящее и будущее биосенсоров

преобразователя мембраной должно быть воспроизводимо. Соответствующая

технология формирования поверхности должна допускать возможность

изготовления достаточно миниатюрного электрода. Кроме того, биосенсоры со

сравнительно толстыми мембранами дают в итоге большее время отклика,

имеются сложности и при их градуировке. Успехи в области развития средств

микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосенсоров к новым

решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарную

технологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытий и т. д.), по

которой можно изготовить так называемый биочип, объединяющий сенсорную

систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор для

измерения аналитического сигнала и расчета результатов анализа. Хотя такие

биочипы могут тиражироваться, основной проблемой в данном случае будет

являться воспроизводимость состояния, то есть микроструктуры поверхности с

нанесенным слоем биологически активного фермента. Трудной задачей

представляется в данном случае и оптимизация такой структуры в отличие от

объемной технологии, реализованной присутствием в конструкции сенсорной

части нескольких молекулярных слоев. Тем не менее "молекулярный дизайн" при

конструировании биосенсоров будущего может составить реальную конкуренцию

объемному их варианту.

Где применяют биосенсоры

По-видимому, самым распространенным в настоящее время является

амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для

определения сахара в крови. Исторически этот биосенсор является самым

"древним". В настоящее время для определения глюкозы создано наибольшее

число различных биосенсоров, что связано с необходимостью контроля за

содержанием сахара в биологических жидкостях, например в крови, при

диагностировании и лечении некоторых заболеваний, прежде всего диабета.

Схема функционирования биосенсора на глюкозу в принципе типична и для

других амперометрических биосенсоров с аналогичным трансдьюсером. Ток

восстановления кислорода на платиновом катоде прямо пропорционален

концентрации кислорода. В присутствии субстрата (например, глюкозы в крови,

взятой для анализа) ферментативная реакция понижает концентрацию O2.Таким

образом, ток восстановления кислорода уменьшается пропорционально

концентрации субстрата

Преимущество данного типа биосенсора состоит прежде всего в его

высокой селективности. Избирательность подобных биосенсоров определяется

высокой специфичностью глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции,

в которой участвуют компоненты ферментативного процесса. В целом класс

ферментов - оксидаз является высокоспецифичным по отношению к определяемым

субстратам. Системы же на основе небиологического преобразователя,

напротив, не столь селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом

причин. Тем не менее имеются ограничения и по применению данной конструкции

биосенсора, обусловленные влиянием кислорода и других посторонних веществ,

способных проникать через биослой (точнее, через мембрану), а потому задача

совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозу представляется весьма

актуальной.

Один из возможных путей такого усовершенствования заключается в

следующем. Если изменить полярность включения электрода-трансдьюсера в

глюкозном биосенсоре на противоположную, то есть платиновый катод сделать

анодом, то при потенциале +0,6В он становится совершенно нечувствительным

к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода, который при данном

значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность такого электрода к

пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку вода образуется

как продукт ферментативной реакции, по его содержанию можно сделать вывод о

концентрации, например глюкозы в различных объектах. Другой способ

улучшения селективности биосенсоров и устранения помех от посторонних

примесей состоит в использовании различных мембран - пленок,

предотвращающих их попадание непосредственно на электрод-преобразователь.

При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защиты от примесей, а

внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Однако необходимо отметить,

что с помощью специальных приемов, называемых химической модификацией,

можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода, что он

будет "глухим" к большинству примесей и, напротив, чувствительным к

компонентам ферментативной реакции.

Биосенсоры, основанные на кислородном электроде как физическом

трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме

глюкозы - лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, то есть

анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие

биосенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.

С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой

определенной концентрации субстрата оценивать активность собственно

фермента по величине измеряемого сигнала ( потенциала, тока и т. д.). Из

описания работы фермента следует, что измеряемый сигнал зависит не только

от концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического

преобразователя, то есть фермента. Такое использование биосенсоров

позволяет измерить активность большого числа ферментов, например в крови.

Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью, таких,

как аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа, позволяет в клинических

условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента

амилазы используются в педиатрии.

Биосенсоры на основе других биоматериалов

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, использование

выполненных на их основе биосенсоров не может быть экономически

целесообразным. Поэтому применение бактерий, микроорганизмов и

биологических тканей различного происхождения более предпочтительно,

поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном

получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосенсоров

можно отнести низкую селективность определения вследствие того, что клетки

живых организмов фактически являются источником самых разнообразных

ферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на основе тканей и

микроорганизмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их

практическую ценность. Тем не менее в последнее время наблюдается

повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержащих не сами

ферменты в очищенном виде, а их первозданные источники - биологические

материалы. Так, было установлено, что тканевые срезы в биосенсорах могут

выполнять функцию источников каталитической активности. Например, создан

биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из платинового электрода и

пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы.

Активность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-

80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что

пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года

в 50%-ном глицерине.

Аналогичный подход использовали при создании конструкции биосенсора на

допамин - важнейший биогенный амин, участвующий в регуляции деятельности

мозга. В данном биосенсоре ткань плода банана была иммобилизована на

поверхности кислородного электрода. В рассмотренных случаях биоматериалы

создают "естественное окружение" для ферментов, способствующее стабилизации

их активности. Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую

специфичность, что очень важно для биосенсора, тогда как выделенные

ферменты в тех же условиях быстро разрушаются. Известны биосенсоры, в

которых использован цельный фрагмент ткани печени быка, являющийся

носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородном электроде.

Ферментативное действие каталазы, проявляющееся в катализе реакции

разложения пероксида водорода, используют в этом случае для создания

соответствующего электрода. Разработан биосенсор на основе кожуры кабачка

или огурца и кислородного электрода для определения L-аскорбиновой кислоты

во фруктовых соках, функционирующий подобно аналогичному типу электрода,

уже рассмотренного выше. Тем не менее, несмотря на успехи в развитии

биосенсоров на основе биологических материалов, надежность их

функционирования все еще остается спорной. Еще один пример конструкции

биосенсорного устройства относится к ферментному электроду на основе

микроорганизмов - дрожжей, помещаемых между двумя пористыми мембранами.

Биосенсор на основе иммобилизованных дрожжей и кислородного электрода

позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.

Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране

микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного сенсора. В

качестве примера таких устройств можно упомянуть амперометрический сенсор

на аммиак (в сточных водах) на основе иммобилизованных нитрифицирующих

бактерий и кислородного электрода. Такой биосенсор полезен при решении

вопросов охраны окружающей среды, и в частности при контроле степени

очистки промышленных стоков.

Можно отметить также использование биосенсоров на основе гидролаз -

ферментов, являющихся катализаторами гидролитического расщепления

субстратов. Эти биосенсоры предназначаются, как правило, для эколого-

аналитического контроля остаточных количеств пестицидов класса

фосфорорганических соединений, а также для определения некоторых ОВ. Если

при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется

электрохимически активное соединение, то, контролируя содержание

последнего, можно контролировать ферментативную реакцию так же, как в

предыдущих случаях. Однако в присутствии веществ, являющихся ингибиторами,

активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу,

регистрируемому электродом. Интересно отметить высокую чувствительность

такого определения: эффект изменения активности фермента доступен для

измерения уже при действии ультраследовых количеств ингибитора - на уровне

пико- и фемтограмм

Проблемы и перспективы развития

Концепция распознавания определяемого вещества с помощью

иммобилизованного биоматериала оказалась плодотворной. В итоге

исследователи приобрели новое средство, позволяющее быстро получить

достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровья человека.

Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуального

использования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в

крови). Интерес к биосенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись

четыре крупные международные конференции по биосенсорам.

Если иметь в виду все разнообразие ферментов, присутствующих и

действующих в живом организме и являющихся потенциальными биологическими

преобразователями, то следует отметить, что существующее сегодня число

конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз.

Биосенсоры получают распространение в биотехнологии. Хотя здесь и

встречаются трудности, связанные с невысокой термической устойчивостью

предложенных устройств, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания

полагать, что данный недостаток будет в скором времени преодолен. Так,

полагают, что для увеличения срока службы биосенсоров в обозначенных выше

условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий и

одноклеточных водорослей - микроорганизмов, устойчивых к действию высоких

температур. Определенные трудности представляют собой также проблемы

градуировки биосенсоров и надежности их показаний. Для улучшения последнего

показателя, в частности, предлагается использовать мультисенсорную систему,

состоящую из ряда биочипов. Для получения определенной "емкости" надежных

данных производится расчет необходимого числа таких датчиков. Однако в

целом так называемые метрологические характеристики биосенсоров вполне

приемлемы. Относительное стандартное отклонение определяемой концентрации

не выше 10-12 %, притом что нижняя граница определяемых содержаний

достигает 10-15 моль/л. Некоторые биосенсоры работают по принципу да-нет,

что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультрамалых

количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. Если

определяемые компоненты находятся в сложной смеси или матрице или же близки

по своим свойствам, то при анализе используют хроматографические методы

разделения. Контроль за разделением осуществляют с помощью системы

детекторов на основе биосенсоров. И здесь получены поразительные

результаты: разделяют и количественно определяют оптические активные

изомеры, различные сахара (лактозу, фруктозу, глюкозу и т.д.), сложные по

структуре биологически активные соединения и т.п.

Вот один из недавних примеров разработки биосенсоров, основанных на

использовании природного хеморецептора. Хеморецептор, извлеченный из

чувствительных антенн (органелл) голубого морского краба, был прикреплен к

ультрамикроэлектроду, измеряющему потенциал. В результате был изготовлен

новый тип потенциометрического детектора, чрезвычайно быстро реагирующего

на ничтожные изменения состава среды, в которую он погружен. Сам голубой

краб очень чувствителен к следам тяжелых металлов и живет только в

чистейшей морской воде.

На очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых

организмов, что позволит создать "искусственные органы" обоняния и вкуса, а

также применить указанные разработки для возможно более точной и

информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем

будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых

открытий.

Литература

1. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Э. Тернера и др. М.: Мир,

1992. 614 с.

2. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с

модифицированными и ультрамикроэлектродами. М.: Наука, 1994. 239 с.

3. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С. // Успехи химии. 1991. Т.

60. С. 881.

Страницы: 1, 2