Методы исследования в цитологии

дает биохимикам возможность разделять органеллы одинаковых размеров, но

разной плотности (рис. 1.).

[pic]

Радиоавтография – сравнительно новый метод, безмерно расширивший

возможности как световой, так и электронной микроскопии. Это в высшей

степени современный метод, обязанный своим возникновением развитию ядерной

физики, которое сделало возможным получение радиоактивных изотопов

различных элементов. Для радиоавтографии необходимы, в частности, изотопы

тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с

веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или

добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного

метаболизма. Поскольку радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество)

участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог,

и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно

проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Один из

способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать

на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь

черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и

оказывает на пленку такое же действие, как свет.

Чтобы на препаратах, предназначенных для изучения с помощью светового

или электронного микроскопов, можно было обнаружить излучение, испускаемое

радиоактивными изотопами, препараты покрывают в темном помещении особой

фотоэмульсией, после чего оставляют на некоторое время в темноте. Затем

препараты проявляют (тоже в темноте) и фиксируют. Участки препарата,

содержащие радиоактивные изотопы, воздействуют на лежащую над ними

эмульсию, в которой под действием испускаемого излучения возникают темные

«зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (от греч. радио –

лучевидный, аутос – сам и графо – писать).

Вначале гистологи располагали лишь несколькими радиоактивными

изотопами; так, например, во многих ранних исследованиях с применением

радиоавтографии использовался радиоактивный фосфор. Позднее стали

использовать значительно больше таких изотопов; особенно широкое применение

нашел радиоактивный изотоп водорода – тритий.

Радиоавтография имела и имеет до сих пор очень широкое применение для

изучения того, где и как в организме протекают те или иные биохимические

реакции.

Химические соединения, меченые радиоактивными изотопами, которые

используются для исследования биологических процессов, называют

предшественниками. Предшественники – это обычно вещества, подобные тем,

которые организм получает из пищи; они служат строительными блоками для

построения тканей и включаются в сложные компоненты клеток и тканей таким

же образом, как в них включаются немеченые строительные блоки. Компонент

ткани, в который включается меченый предшественник и который испускает

излучение, называется продуктом.

Клетки, выращиваемые в культуре, хотя и принадлежат к одному и тому

же типу, в любой данный момент времени будут находиться на разных стадиях

клеточного цикла, если не принять специальных мер для синхронизации их

циклов. Тем не менее, путем введения в клетки тритий-тимидина и

последующего изготовления радиоавтографов можно определить

продолжительность различных стадий цикла. Время наступления одной стадии –

митоза – можно определить и без меченого тимидина. Для этого выборку клеток

из культуры держат под наблюдением в фазово-контрастном микроскопе, который

дает возможность непосредственно следить за течением митоза и устанавливать

его сроки. Продолжительность митоза обычно равна 1 ч, хотя в клетках

некоторых типов он занимает до 1.5 ч.

Определение продолжительности G 2-периода.

Для определения продолжительности G 2–периода применяют метод,

известный под названием импульсной метки: к культуре клеток добавляют

меченый тимидин, а спустя короткое время заменяют культуральную среду

свежей, с тем, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение клетками меченого

тимидина. При этом метку включают только в те клетки, которые в течение

кратковременного пребывания в среде с тритий-тимидином находились в S-

периоде клеточного цикла. Доля таких клеток невелика и лишь небольшая часть

клеток получит метку. Кроме того, все клетки, включающие метку, будут

находиться в интерфазе – от клеток, едва вступивших в S-период, до таких,

которые почти закончили его за время воздействия тритий-тимидина. В пробе,

взятой сразу после удаления меченого тимидина, метка содержится только в

интерфазных ядрах, принадлежащих клеткам, которые в период воздействия

метки находились в S-периоде; те же клетки, которые в этот период

находились в состоянии митоза, остаются немечеными.

Если затем продолжать отбирать из культуры пробы через определенные

промежутки времени и изготовлять для каждой последовательной пробы

радиоавтограф, то наступит момент, когда метка начнет появляться в

митотических d-хромосомах. Метки будут включаться во все те клетки,

которые в период наличия в среде тритий-тимидина находились в S-периоде,

причем среди этих клеток будут как только что вступившие в S-период, так и

почти закончившие его. Совершенно очевидно, что эти последние первыми среди

меченых клеток проделают митоз и, следовательно, в их митотических

хромосомах обнаружится метка. Тем самым промежуток между 1) временем, когда

из культуры был удален меченый тимидин, и 2) временем появления меченых

митотических хромосом будет соответствовать продолжительности G 2–периода

клеточного цикла.

Определение продолжительности S-периода.

Поскольку клетки, находящиеся в момент введения в среду метки в самом

конце S-периода, первыми вступят в митоз, то, следовательно, в тех клетках,

у которых S-период начинается непосредственно перед удалением метки,

меченые митотические хромосомы появятся в последнюю очередь. Поэтому, если

бы нам удалось определить промежуток между временем вступления в митоз

клеток, помеченных первыми, и клеток, помеченных последними, мы установили

бы продолжительность S-периода. Однако, хотя время, когда впервые

появляются меченые митотические хромосомы, установить легко, время

вступления в митоз клеток, помеченных последними, определить невозможно

(этому препятствует очень большое количество меченых делящихся клеток в

последних пробах). Поэтому продолжительность S-периода приходится

определять другим способом.

При исследовании радиоавтографов последовательных проб клеток,

отбираемых через одинаковые промежутки времени, обнаруживается, что доля

клеток, несущих метку в своих митотических хромосомах, постепенно

возрастает, пока мечеными не окажутся буквально все делящиеся клетки.

Однако, по мере того как клетки одна за другой завершают митоз, они

превращаются в меченые интерфазные клетки. Первыми завершают митоз те из

меченых клеток, которые вступили в него первыми; и соответственно из клеток

с мечеными митотическими хромосомами последними завершают митоз те, которые

вступили в него позже всех. Поскольку продолжительность митоза всегда

одинакова, то, следовательно, если бы мы могли определить промежуток между:

1) временем окончания митоза в клетках, включивших метку первыми, и 2)

временем окончания митоза в клетках, включивших метку последними, мы

установили бы продолжительность S-периода. Продолжительность S-периода

нетрудно установить, определив промежуток между: 1) моментом времени, когда

50% митотических клеток в культуре несут метку, и 2) моментом времени,

после которого культура уже не содержит 50% меченых клеток.

Определение времени генерации (общей продолжительности всего

клеточного цикла).

Продолжая отбирать из культуры пробы клеток, можно обнаружить, что

меченые фигуры митоза в какой-то момент совершенно исчезают, а затем

появляются вновь. Такие делящиеся клетки представляют собой дочерние

клетки, происходящие от тех материнских клеток, которые включили метку,

находясь в момент воздействия тритий-тимидина в S-периоде. Эти материнские

клетки перешли в S-период, разделились, а затем прошли через вторую

интерфазу и второе деление, то есть проделали один полный цикл и часть

следующего. Время, необходимое для прохождения полного клеточного цикла,

называется временем генерации. Оно соответствует промежутку между двумя

последовательными пиками включения метки и обычно соответствует отрезку

между теми точками последовательных восходящих кривых, в которых 50% фигур

митоза содержат метку.

Литература.

А.Хэм, Д.Кормак «Гистология», том 1 Москва «МИР» 1982;

М.Г.Абрамов «Клиническая цитология» Москва «МЕДИЦИНА» 1974;

Ю.С.Ченцов «Общая цитология»

Страницы: 1, 2