Энергетические вещества тканей почки
веществе преобладает активность ЛДГ1 и ЛДГ2, а в мозговом - ЛДГ5 и ЛДГ4.
При острой почечной недостаточности в сыворотке крови повышается активность
анодных изоферментов ЛДГ, т. е. изоферментов с высокой электрофоретической
подвижностью (ЛДГ1 и ЛДГ2) .
Определённый интерес представляет также исследование изоферментов
аланинаминопептидазы (ААП). Известны 5 изоферментов ААП. В отличие от
изоферментов ЛГД изоферменты ААП определяются в различных органах не в виде
полного спектра (5 изоферментов), а чаще как один изофермент. Так,
изофермент ААП1 представлен главным образом в ткани печени, ААП2 – в
поджелудочной железе, ААП3 – в почках, ААП4 и ААП5 – в различных отделах
стенки кишки. При повреждении ткани почек изофермент ААП3 обнаруживается в
крови и моче, что является специфическим признаком поражения почечной
ткани.
Через фильтрующую мембрану клубочка практически не проходят альбумины и
глобулины, но свободно фильтруются пептиды. Тем самым в канальцы
непрестанно поступают гормоны, изменённые белки. Их расщепление имеет
двоякое физиологическое значение – организм освобождается от физиологически
активных веществ, что улучшает точность регуляции, а в кровь возвращаются
аминокислоты, используемые для последующих синтезов. Имеющиеся данные
указывают на возможность извлечения некоторых белков и полипептидов
клетками нефрона из околоканальцевой жидкости и их последующего разрушения.
Таким образом, почка играет важную роль в расщеплении низкомолекулярных
и изменённых (в том числе денатурированных) белков. Это объясняет значение
почки в восстановлении фонда аминокислот для клеток органов и тканей, в
быстром устранении из крови физиологически активных веществ и сохранении
для организма их компонентов.
Почка не только потребляет глюкозу в процессе обмена, но и обладает
способностью к значительной её продукции. В обычных условиях скорости двух
последних процессов равны. Использование глюкозы для выработки энергии в
почке составляет около 13% общего потребления кислорода почкой.
Глюконеогенез происходит в коре почки, а наибольшая активность гликолиза
характерна для мозгового вещества почки.
Почка обладает весьма активной системой образования глюкозы, её
интенсивность на 1 г массы почки больше, чем в печени. При длительном
голодании в почках образуется половина общего количества глюкозы,
поступающей в кровь. Для этого используются органические кислоты, которые
превращаются в глюкозу, являющуюся нейтральным веществом, что способствует
одновременно регуляции pH крови. При алкалозе, напротив, снижен уровень
глюконеогенеза из кислых субстратов. Зависимость скорости и характера
глюконеогенеза от велечины pH является особенностью углеводного обмена
почки по сравнению с печенью.
Превращение различных субстратов в глюкозу, поступающую в общий
кровоток и доступную для утилизации в различных органах и тканях,
свидетельствует о том, что почки присуща важная функция, связанная с
участием в энергетическом балансе организма.
Почка оказалась основным органом окислительного катаболизма инозитола.
В ней миоинозитол окисляется в ксилулозу и затем через ряд стадий в
глюкозу. В тканях почки синтезируется фосфатидилинозитол, являющийся
необходимым компонентом плазматических мембран. Синтез глюкуроновой кислоты
имеет большое значение для образования гликозаминогликанов, содержание
которых высоко в межклеточной ткани внутреннего мозгового вещества почки и
столь существенно для процесса осмотического разведения и концентрирования
мочи.
Участие в обмене липидов связано с тем, что свободные жирные кислоты
извлекаются почкой из крови и их окисление обеспечивает в значительной
степени работу почки. Так как свободные жирные кислоты связаны в плазме с
альбумином, то они не фильтруются, а их поступление в клетки нефрона
происходит со стороны межклеточной жидкости. Эти соединения окисляются в
большей степени в коре почки, чем в её мозговом веществе. В почке
образуются триацилглицерины. Свободные жирные кислоты быстро включаются в
фосфолипиды почки, играющие важную роль в выполнении различных транспортных
процессов. Роль почки в липидном обмене состоит в том, что в её ткани
свободные жирные кислоты включаются в состав триацилглицеринов и
фосфолипидов и в виде этих соединений поступают в циркуляцию.
2.Экспериментальная часть.
2.1. Методы и материал исследования.
Исследования тканей почки проводились на половозрелых 7 месячных белых
крысах генетической линии Вистар женского пола(2шт.) и мужского (1 шт.)
(табл.1).
Табл.1 Материал исследования
|№ п/п |Масса животного, г |Масса почки, г |
|1 |234,0 (9,8 |1,05(0,08 |
|2 |249,7(9,8 |0,76(0,08 |
|3 |214,9(9,8 |0,70(0,08 |
|Среднее значение |232,9 |0,84 |
Метод 1. Определение глюкозы.
Глюкоза определялась редуктометрическим феррицианидным методом. Принцип
метода состоит в следующем: белки ткани осаждаются гидроксидом кадмия.
Глюкоза, содержащаяся в безбелковом фильтрате, окисляется в щелочной среде
феррицианидом калия (красная кровяная соль), избыток которого определяется
иодометрически. Образовавшийся ферроцианид калия связывается сернокислым
цинком, который входит в состав “тройного раствора”[6].
Метод 2. Определение гликогена.
Стадия 1. Выделение гликогена. Принцип метода заключается в следующем:
ткань подвергается десмолизу в 30%-м гидроксиде калия (заменять на
гидроксид натрия нельзя, так как при этом образуются плохо растворимые в
спирте натриевые мыла и сода – это затрудняет последующую очистку осадка
гликогена). Из десмолизата гликоген осаждается спиртом.
Стадия 2. Осаждённый гликоген подвергается гидролизу, и образовавшаяся
глюкоза определяется редуктометрическим феррицианидным методом (метод 1)
[6].
Метод 3. Совместное определение пирувата и лактата.
Стадия 1. Построение калибровочного графика для определения пирувата.
Составляется ряд стандартных растворов пирувата (включая контроль – С=0).
Строится график зависимости оптической плотности растворов от концентрации
пирувата в растворах.
Стадия 2. Построение калибровочного графика для определения лактата.
Составляется ряд стандартных растворов лактата (включая контроль – С=0).
Строится график зависимости оптической плотности растворов от концентрации
лактата в растворах.
Стадия 3. Определение количества пирувата в тканях почки
колориметрическим методом с 2,4-динитрофенилгидразином (по Умбрайту).
Принцип метода состоит в том, что пируват взаимодействует в кислой среде с
2,4-динитрофенилгидразином. Образующийся в результате реакции 2,4-
динитрофенилгидразид пировиноградной кислоты в отличие от гидразидов
других кетокислот хорошо растворим в толуоле, при помощи которого его
экстрагируют из реакционной смеси и создают щелочную среду, в которой он
приобретает коричнево-красную окраску. Определение проводят
колориметрически.
Стадия 4. Определение количества лактата в тканях почки методом с
использованием п-оксидифенила (по Баркеру и Саммерсону). Принцип метода.
Молочная кислота кипячением с конц. серной кислотой превращается в
ацетальдегид, который при конденсации с п-оксидифенилом образует 1,1-ди-
(оксидифенил)-этан. Этот продукт конденсации в растворе серной кислоты
окисляется в продукт фиолетового цвета. Серная кислота действует здесь как
конденсирующий агент и окислитель. Интенсивность окраски пропорциональна
количеству ацетальдегида, а, следовательно, и количеству лактата. Метод
позволяет определять лактат в количествах от 0,03 до 0,2 мкмоль (2,7 – 18,0
мкг) в пробе.
2.2. Результаты и их обсуждение
При проведении эксперимента были получены следующие результаты
(табл.2):
Табл.2 Содержание метаболитов в тканях почки в мг%.
|Метаболит |Содержание метаболита |
| |экспериментальное |литературное |
|глюкоза |27,9(1,6 |54(6 [7] |
|гликоген |48,1(2,2 |50,4(3,5 [8] |
|лактат |35,95 |32,4(1,8 [9] |
|пируват |1,93(0,19 |2,64(0,1 [10] |
Приведём калибровочные графики для определения содержания пирувата и
лактата:
[pic]
[pic]
В источнике [7] содержание глюкозы в тканях почки определялось о-
толуидиновым методом, сущность которого заключается в ферментативном
окислении глюкозы до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода,
которая затем определялась с помощью о-толуидина. Этот метод более
специфичен для определения глюкозы чем феррицианидный, так как исключает
практически все побочные процессы.
В источнике [8] для определения гликогена ткани почек для исследования
брали прижизненно под местной новокаиновой анестезией. Количество общего
гликогена определяли по методу Пфлюгера. Количество истинной глюкозы
определяли по методу Нельсона. Эти методы более специфичны. Этим можно
объяснить расхождение в результатах по гликогену.
В источнике [10] в основу определения пирувата положен ферментативный
метод. Он основан на непрямом определении количества оксалоацетата,
синтезируемого в ходе ферментативной реакции из пирувата и двуокиси
углерода по окислению НАДН в присутствии избытка малатдегидрогеназы. Убыль
НАДН регистрировали спектрофотометрически. Этим можно объяснить расхождение
в результатах по пирувату, так как метод более специфичен. Вид
калибровочного графика позволяет говорить о систематической ошибке, однако,
расхождение в литературных и экспериментальных данных невелико.
В источнике [9] в основу определения содержания лактата положен метод
Хохорста. Принцип метода. В присутствие лактатдегидрогеназы лактат
переходит в пируват, причём связывание образуется в ходе реакции пирувата с
гидразин-глициновым буфером, что способствует полному окислению лактата.
Образовавшееся количество НАДН эквимолярно количеству окисленного
лактата. Регистрацию проводили спектрофотометрически.
Выводы
В ходе экспериментальной работы были получены результаты, которые были
сопоставлены с литературными данными. К сожалению, не удалось найти статьи,
в которой был бы использован феррицианидный метод (во всех работах
использовались разнообразные ферментативные методы), а также не во всех
работах использовались крысы – линии Вистар (в источнике [7] опыты
проводились на беспородных крысах обоих полов). Поэтому, литературные
данные могут быть не достаточно точными по отношению к данной линии.
Однако, результаты, полученные в опытах, в основном совпали с литературными
данными, кроме глюкозы. По-видимому в опыте с определением глюкозы в почке
была допущена грубейшая ошибка. Но результаты можно считать, на мой
взгляд, приемлемыми.
Список использованной литературы:
1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., Биологическая химия – М., Медицина,
1998 г.
2. Физиология человека /Под ред. Смирнова В.М./ – М., Медицина,2001 г.
3. Общий курс физиологии человека и животных /Под ред. Ноздрачёва А.Д./
– М., Высшая школа, 1991 г.
4. Страйер Л., Биохимия, – М., Мир, 1984 г.
5. Биохимия человека, Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., – М.,
Мир, 1993 г.
6. Пандакова В.Н., Цупило И.А., Лабораторный практикум по обмену
веществ, – Донецк, ДонГУ, 1990 г.
7. Украинский биохимический журнал, 1986 г., т. 58, №6, “Гликолиз в
почках крыс в ранний период после ишемии и при введении ингибиторов
кальмодуллина – АМФ и НАД ”, И.З.Тамарина, Г.В. Лысцова, В.И.
Чумаков.
8. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1979 г., т. 87,
№6; “Измерение активности ключевых ферментов глюконеогенеза в печени
и почках крыс при действии субэкстремальных и экстремальных
факторов”, Панин Е.
9. Пируват и лактат в животном организме /под ред. Островского/ –
Минск, 1984 г.
10. Биохимия, т. 35, вып. 1, 1970 г., “Глюконеогенез и гликолиз в почках
крыс нормальных и с аллоксановым диабетом”, В.С. Ильин, М.Д.
Балябина.
11. Большая Советская Энциклопедия, том 1, 3, 4, 15, 20, 21, М.,
1975
12. Физиология почки, под ред. Ю.В. Наточина, Л., 1972
13. Основы нефрологии, под ред. Е.М. Тареева, М., 1972
