Белок - основа жизни
Белок - основа жизни
Приложение № …
Описание некоторых лабораторно-практических работ, используемых при
апробации спецкурса „Белок – основа жизни“.
I. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.
Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических жидкостях.
1. Выделение казеина из молока.
Вариант I.
В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл
молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и
добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают
аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок растворяется.
Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.
Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл дистиллированной
воды, перемешивают и оставляют ещё на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с
осадка. К осадку ещё раз добавляют 10 мл дистиллированной воды, осторожно
перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют смесь через
бумажный фильтр.
Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор: осадок с
фильтром переносят в широкую пробирку с обратным холодильником и добавляют
6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Пробирку нагревают на песчаной
бане в течение 1 часа. Жидкости дают остыть и нейтрализуют её
концентрированной азотной кислотой до слабокислой реакции на лакмус. При
нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного
гидролиза белка.
После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают
биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5 каплям
гидролизата добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого раствора CuSO4.
Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива
добавляют 5 капель гидролизата и кипятят несколько минут. В присутствии
H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении выпадает
жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения (NH4)3PO4(12MoO3.
Вариант II.
К 50-ти мл свежего молока добавляют равный объём насыщенного раствора
сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и казеин.
Отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр раствор альбуминов.
2. Получение раствора яичного альбумина.
Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и
выливают белок в стакан вместимостью 500 мл. В тот же стакан добавляют 250
мл дистиллированной воды и содержимое стакана тщательно перемешивают
стеклянной палочкой с резиновым наконечником.
Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора доводят до
300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор оставляют на 30 минут при
комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов,
затем разливают в пробирки по 20 мл.
20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для дальнейшей работы.
3. Выделение белков мяса.
Помещают в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного
мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и оставляют смесь стоять 15-
20 минут при частом помешивании. Отфильтровывают через бумажный складчатый
фильтр или через двойной слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В
растворе содержатся главным образом, мышечный альбумин и глобулин.
4. Выделение растительных альбуминов.
25 грамм пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной воды, и
смесь стряхивают в течение одного часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки
центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр.
Отфильтрованный прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин
пшеничных зёрен.
II. Реакции осаждения белков.
Цель: выявить влияние различных органических и неорганических веществ
на осаждение белков. Изучить физические свойства белков.
1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.
В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO3, H2SO4,
HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке добавляют из
пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так чтобы он не смешивался с
кислотой. Вместе соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный
осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии HNO3,
увеличивается, а осадки выпавшие при действии HCl и H2SO4, растворяются в
их избытке.
Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые осаждения
белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с
денатурацией белка.
2. Осаждение белков органическими кислотами.
В две пробирки добавляют по 2-3 мл раствора белка и добавляют в одну
из них несколько капель 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а в
другую – несколько капель 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты. В
обоих случаях наблюдается выпадение осадка белка. Сульфосалициловая и ТХУ
кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок.
ТХУ кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка
и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для полного удаления белков из
биологических жидкостей (например, сыворотки крови).
3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
В две пробирки добавляют по 1-1,5 мл исследуемого пастора белка, по
каплям при встряхивании, добавляют в одну из них раствор CuSO4, а другую –
Pb(CH3COO)2. Выпадает хлопьевидный осадок вследствие образования
малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди – голубого цвета).
При избытке реактива осадок снова растворяется.
Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое
осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Потому
что белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например,
ртутными солями (сулема).
III. Гидролиз белка.
Цель: дать учащимся представление о кислотном, щелочном и
ферментативном гидролизе белка. Опытным путём установить продукты распада
белковой молекулы.
1. Кислотный гидролиз простого белка.
При гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные продукты
– пептоны, затем на полипептиды и, наконец, на аминокислоты.
Для гидролиза отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного
белка и 5 мл концентрированной HCl. Колбу закрывают пробкой с длинной
стеклянной трубкой. Кипятят содержимое колбы под тягой в течение 45 или 90
минут.
Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при
помощи биуретовой реакции. Промежуточные продукты распада белка – пептоны –
при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а
белки – сине-фиолетовое.
2. Ферментативный гидролиз белка.
Подготовительный этап: белок куринового яйца развести 1:1 водой и
раствор белка влить в кипящую воду (V=100 мл) при помешивании.
В две пробирки налить по 2 мл приготовленного раствора белка. В первую
добавить 1 мл дистиллированной воды, во вторую – 1 мл 1%-го раствора
пепсина. Обе пробирки поставить в водяную баню при t=37-40 0C на 15 минут.
Проделать биуретовую реакцию с содержимым обеих пробирок.
В воде окраска более интенсивная (фиолетовая с синим оттенком), так
как при гидролизе осталось больше пептидных связей, чем в случае с пепсином
(окраска менее интенсивная – фиолетовая с розовым оттенком) – меньше
пептидных связей.
В присутствии пепсина гидролиз идёт интенсивнее, чем в присутствии
воды.
IV. Денатурация белков.
Цель: определить факторы, вызывающие денатурацию белка.
4.1. В три пробирки наливают по два мл раствора белка куриного яйца,
предварительно разведённого 1:20 и профильтрованного через двойной слой
марли.
В первую пробирку наливают насыщенный раствор сульфата аммония; во
вторую – концентрированную HNO3; в третью – этиловый спирт. Белок
свёртывается во всех пробирках.
4.2. В три пробирки добавляют по 2 мл раствора белка. Во вторую
добавляют одну каплю 1%-го раствора уксусной кислоты; в третью – одну каплю
10%-го раствора NaOH. Все три пробирки нагревают над пламенем спиртовки.
В первой пробирке (pH=7) образуется осадок белка, вследствие его
денатурации при нагревании, во второй пробирке осадок образуется быстрее и
полнее вследствие нейтрализации белка в слабокислой среде; в третьей
пробирке (pH>7) осадка не образуется даже при кипячении.
V. Качественные реакции на белки.
(Цветные реакции на белки; определение аминокислотного состава
белков).
Цель: Путем качественных реакций определить наличие пептидных связей и
Страницы: 1, 2
